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图34 死亡的门槛
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自由基泄漏触发细胞死亡（凋亡）的临界点，不同物种之间应该不同，这取决于它们的有氧代谢能力。有氧需求很高的生物，需要线粒体基因组与核基因组完美匹配。如果自由基以较高的速率从运作不良的呼吸链中泄漏，就说明兼容性不够好（见图32）。如果对基因组兼容性要求很高，细胞就会对自由基泄漏很敏感，即使较低的泄漏也会成为匹配不佳的警报，触发细胞凋亡（低门槛）。相反，如果有氧需求不高，细胞敏感自杀就没有什么好处。这样的生物可以忍受更多的自由基泄漏，不会触发细胞凋亡程序（高门槛）。对于高/低死亡门槛的特征预测，列在图的两侧。理论上，鸽子有典型的低门槛，而大鼠有典型的高门槛。这两种动物的体型和基础代谢率都相仿，但是鸽子的自由基泄漏率低得多。这些预测的正确性还有待验证，然而有一个不争的事实：大鼠只能活三四年，鸽子却可以活三十年。
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我刚才称之为“假设的死亡门槛”，因为它目前还只是假设。死亡门槛真实存在吗？如果存在，它确实很重要吗？我们先考虑人类自身的问题。人类大约有40%的怀孕最终会以早期隐性流产（early occult miscarriage）收场。这里的“早期”是指非常早的阶段，怀孕的最初几周内：通常在出现任何明显的怀孕征兆之前，直到结束你根本不知道自己怀孕了。“隐性”是指流产也是隐蔽的，没有临床症状。通常我们都不知道发生了这种流产，原因也不清楚。它不是缘于那些常见的原因，比如染色体分离失败造成的三体（trisomy）缺陷⑫。那有可能是生物能量方面的问题吗？是或不是都很难证明。不过，在这个可以进行快速全基因组测序的新时代，我们有望找到答案。不孕不育对患者造成的巨大精神痛苦，让一些有损健康的实验获准进行，用以研究促进胚胎发育的方法。例如，一种笨拙得吓人的招数——把ATP直接注入虚弱的胚胎，居然可以延长胚胎的生存时间。很明显，生物能量在这个问题上发挥了影响。同理，也许这些流产的确是自然选择的权宜之计，也许这些胚胎存在线粒体－核不兼容的问题，引发了细胞凋亡。最好不要用道德评判的眼光去看待演化。我只能说，我不会忘记自己也曾为此熬过痛苦的岁月（幸好现在都过去了）。和大多数人一样，我也想知道背后的原因。我怀疑，导致早期隐性流产中很大一部分是缘于线粒体－核不兼容。
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还有另外一个理由让人们相信死亡门槛的存在，以及它的重要性。高死亡门槛会带来一个间接的，然而也是终极的代价：更快地衰老，以及更容易罹患各种老年病。这个观点可能会引起某些抵触情绪。髙死亡门槛意味着可以忍受较多的自由基泄漏，而不至于触发凋亡。也就是说，像大鼠这种有氧代谢能力较低的动物，会有较多的自由基泄漏；相反，像鸽子这种有氧代谢能力很高的动物，自由基泄漏较少。我选这两种动物来比较是经过特别考虑的：它们的体重和基础代谢率几乎一模一样。如果只以这两点为参考，大部分生物学家会预测，它们的寿命应该差不多。但是，马德里大学生理学家古斯塔沃·巴尔哈（Gustavo Barja）的详细研究显示，鸽子线粒体的自由基泄漏比大鼠少得多。⑬根据自由基老化理论，衰老是自由基泄漏造成的。自由基泄漏越厉害，我们老得越快。这个理论过去的名声不太好，但巴尔哈的例子能给出明确的预测：鸽子的寿命应该比大鼠长很多。事实的确如此。大鼠可以活三到四年，鸽子可以活将近三十年。鸽子确实不能简单看成是“会飞的大鼠”。那么，自由基老化理论正确吗？该理论原先那种武断推导的观点当然不正确。但是我仍然认为，一种经过改进的、更精细的自由基老化理论很可能是对的。
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自由基老化理论
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自由基老化理论，源于20世纪50年代的辐射生物学（radiation biology）研究。电离辐射可以分解水分子，生成各种高反应性的“碎片”，带有一个不成对的电子，这就是氧自由基。其中有一些反应性极强，比如恶名昭彰的氢氧自由基（hydroxyl radical，·OH）；其他的相对比较温和，比如超氧自由基。自由基生物学的先驱，包括蕾韦卡·格施曼（Rebeca Gerschman）、丹汉姆·哈曼（Danham Harman）等研究者都认识到：在线粒体中，同样的自由基可以直接从氧气产生，不需要电离辐射。他们认为，自由基的本质具有破坏性，能够损坏蛋白质，造成DNA突变。这些看法都正确。更糟糕的是，自由基分子会引起连锁反应，让附近的分子（通常是膜脂质）一个接一个地抢夺下一个分子的电子，毁坏细胞中的脆弱结构。这些理论认为，自由基最终会在细胞中引起溃堤式的大破坏。想象一下：自由基在线粒体中泄漏，与周围各式各样的分子发生反应，其中当然包括邻近的线粒体DNA。被损坏的线粒体DNA开始累积突变，有些突变会扰乱DNA的功能，结果制造出错误的呼吸蛋白，自由基泄漏变得更严重。如此恶性循环，越来越多的蛋白质和DNA遭到破坏，不久衰退就会蔓延到细胞核，爆发成一场“错误灾变”（error catastrophe）。参考60～100岁各年龄段疾病与死亡人口统计图，其中的发生概率随年龄的增加呈指数级上升，这与“错误灾变”的概念（损害会导致更多的损害，指数级累积增长）似乎有相同的模式。因此，自由基老化理论认为，整个衰老过程都受氧气驱动，但它同时又是我们赖以为生的气体。这个观念就像一位迷人的杀手，让人既感到恐惧，又被它魅惑。
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既然自由基这么坏，那么抗氧化剂就是好的。抗氧化剂会干扰自由基的毒性，阻止连锁反应，因此可以防止损害扩散。如果自由基会导致衰老，那么抗氧化剂就应该能减缓衰老、推迟老年病的发病年龄，或许还能延年益寿。一些著名的科学家，尤其是诺贝尔奖得主莱纳斯·鲍林（Linus Pauling），都相信抗氧化剂的神话；他们采取超量维生素C疗法，每天吃好几匙的剂量。鲍林确实高寿92岁，但这年纪仍在正常范围内，许多人一辈子抽烟喝酒也能活到这个岁数。显然，事情没那么简单。
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对自由基与抗氧化剂这种非黑即白的观念，至今仍在很多时尚杂志和保健食品产业流行，而这个领域的绝大多数科学研究者早就认识到这是错的。我最喜欢的一句评价来自《自由基生物学和医学》（Free Radicals in Biology and Medicine），这是哈利维尔（Barry Halliwell）和古特利基（John Gutteridge）编写的经典教科书：“到90年代已经很清楚，抗氧化剂绝不是抗衰老和疾病的万灵药。只有边缘保健产业还在推销这种观念。”
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自由基老化理论是被残酷事实击倒的漂亮理论之一，而且这个例子中的事实相当残酷。该理论的所有原始立论中，没有一条在严谨的实验测试中站得住脚。研究人类的衰老过程时，我们没有测量到线粒体的自由基泄漏出现任何系统性的增加。线粒体的突变数量会有少许增加，但除了极少数组织区域，整体的突变比例低得惊人，远低于可能引发线粒体疾病的程度。有些组织确实有损伤累积的迹象，但也完全不像所谓的“错误灾变”。况且，这个假说的因果逻辑也颇有问题。抗氧化剂肯定没有延年益寿或者预防疾病的效果，甚至可能有副作用。由于认为抗氧化剂是灵丹妙药的观念曾经流行一时，过去数十年间有几十万人参加了各类临床实验。实验结论很明确：服用高剂量的抗氧化补充剂会有不太严重但确定的健康风险。如果你服用抗氧化补充剂，更可能缩短寿命。很多长寿的动物组织中的抗氧化酶浓度都很低；而寿命较短的动物，组织中的浓度却高得多。更奇怪的是，促氧化剂（pro-oxidants）反而能够延长动物的寿命。鉴于这些事实，老年病学研究领域大多放弃了自由基老化理论。我曾在2002年的早期著作《氧气》中详尽探讨了以上问题。我很希望那时候的先见就已经破除了“抗氧化剂可以抗衰老”的神话，但是显然没有。这出闹剧，甚至在那时就已注定发生。某些人的一厢情愿、另一些人的贪婪，以及科学界缺乏替代理论，纠缠在一起导致愈演愈烈的局面。
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那么，你可能觉得奇怪，为什么我仍然认为一种“经过改进的、更精细的”自由基老化理论是正确的？有几个原因。早期的理论中没有考虑到两个关键因素：自由基信号和细胞凋亡。如前所述，自由基是细胞生理（包括细胞凋亡）信号系统的中心。马德里大学的生物学家安东尼奥·恩里格斯（Antonio Enriques）与同事通过细胞培养实验表明，使用抗氧化剂阻断自由基信号相当危险，可能会抑制ATP合成。看来，自由基信号可以通过增加呼吸蛋白复合体的数量来加强线粒体的呼吸能力，从而分别优化每个线粒体中的呼吸作用。线粒体很多时候都在互相融合，然后再分开，制造更多的蛋白质复合体和更多的线粒体DNA，最终产生更多的线粒体。这个过程就是线粒体生物合成（mitochondrial biogenesis）⑭。泄漏的自由基可以刺激线粒体进行这种生物合成，增加线粒体数量，生产更多的ATP。用抗氧化剂阻断自由基信号，也会同时阻断线粒体生物合成，所以在恩里格斯的实验中，ATP合成反而受到了抑制（图35）。因此，抗氧化剂实际上可能削弱细胞的能量供应。
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图35 抗氧化剂可能有危害
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这是胞质杂合细胞实验结果的示意图。每张图中的核基因组都几乎相同，主要差别在于线粒体DNA。线粒体DNA分两种来源：一种来自与核基因同一种系的小鼠（上图，“低ROS”）；另一种是来自不同种系的小鼠，线粒体DNA有一些差异（中图，“高ROS”）。ROS是活性氧（reactive oxygen species）的缩写，此处等同于线粒体自由基的泄漏速率。图中ATP的合成速率用箭头粗细表示，低ROS和高ROS胞质杂合细胞的ATP合成速率差不多。然而低ROS胞质杂合细胞制造这些ATP很轻松，自由基泄漏得慢（图中用线粒体中的小爆炸图案表示），也只需要较少的线粒体DNA（图中的缠绕线团）。而高ROS杂合细胞的自由基泄漏速率比前者高出两倍多，线粒体DNA的数量也翻倍。所以，自由基泄漏似乎有助于提升呼吸作用。下图的实验从另一个方向支持这个结论：抗氧化剂降低了自由基泄漏，但同时也减少了线粒体DNA的数量，关键是降低了ATP的合成速率。所以，抗氧化剂实际上是扰乱了优化呼吸作用的自由基信号系统。
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但是我们也知道，当自由基的泄漏速度超过门槛时，细胞凋亡就会启动。那么，自由基到底是在帮助优化呼吸作用，还是通过启动凋亡杀死细胞呢？其实，这两方面并不像表面上那么互相矛盾。自由基信号的根本意义在于：线粒体现在有问题，呼吸能力低于任务需求。如果这个问题可以通过制造更多的呼吸蛋白复合体、提升呼吸能力来解决，那么细胞就会这样做，一切恢复正常。但如果这么做还是无法解决问题，细胞就会自杀，消灭自身有缺陷的DNA。如果这个损坏的细胞可以用一个崭新完好的细胞（来自干细胞分化）代替，那么问题也解决了（更准确地说，问题是被消灭了）。
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自由基信号在呼吸作用的优化过程中作用如此重要，所以服用抗氧化剂也无法延年益寿。在细胞培养实验中，它们会抑制呼吸作用，因为细胞培养皿中没有人体正常的安全措施。如果人体大剂量摄入维生素C之类的抗氧化剂，其实绝大部分都不会吸收，倒是很容易拉肚子。就算有多余的抗氧化剂进入血液循环，也会很快经尿液排出，血液中的抗氧化剂浓度会保持稳定。这并不是在提倡避免富含抗氧化剂的食物，你也需要它们，尤其是蔬菜与水果。如果饮食不健康或者身体缺乏维生素，服用一些抗氧化补充剂还能带来好处。但如果在均衡饮食（已经同时含有抗氧化剂和促氧化剂）的前提下还要大量灌下抗氧化剂，那只能起到反作用。如果身体让大剂量的抗氧化剂进入细胞，就会惹出大麻烦，甚至有可能因为缺乏能量而使人送命。因此，身体不会允许它们进入。抗氧化剂的浓度，无论是在细胞内还是细胞外，都受到非常精确的调控。
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而细胞凋亡通过消灭受损的细胞，也消灭了损坏的证据。自由基信号和细胞凋亡推翻了自由基老化理论早期版本做出的绝大部分预测。这也难怪，在提出这个理论的年代，研究人员都还没有发现这两个机制。我们没有观察到自由基泄漏的不断恶化，或是大量的线粒体突变，抑或是氧化损坏在组织中的不断累积；我们也看不到抗氧化剂能带来任何实际好处，也没有所谓的错误灾变。自由基的信号功能和细胞凋亡就是背后的原因，它们也很好地解释了：为什么自由基老化理论的预测几乎全部错了。既然如此，为什么我仍然认为有正确版本的自由基老化理论呢？如果自由基经由精妙的调控可以带来诸多好处，它与衰老之间又存在怎样的关系呢？
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事实上，它确实可以解释不同物种之间的寿命差异。从20世纪20年代开始，研究人员就发现：生物的寿命长短与代谢率有关。性情古怪的生物测量学家雷蒙德·珀尔（Raymond Pearl）曾经就这个问题发表了一篇论文，题为“为什么懒人活得比较长”。实际上懒人并不长寿，反而比较短命。这只是珀尔故作惊人之语，目的在于引出他著名的“生命率理论”（rate-of-living theory）。这个理论本身倒是有些事实根据。代谢率较低的动物（通常是大象等大型物种），一般比代谢率较高的动物（比如大鼠和小鼠）寿命长。⑮这一规律应用在爬行类、哺乳类和鸟类等同一大类生物内部相当准确，但在各大类之间比较时完全不成立。所以，该理论受到过不少质疑，或者说被无视了。然而，这个理论有一个简单的解释，我们已经很熟悉了：自由基泄漏。
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自由基老化理论原始的假设认为，自由基是呼吸作用不可避免的副产物，参与呼吸作用的氧气中大约有1%～5%一定会转化为自由基。这个假设有两个错误。首先，所有传统实验测量的都是细胞或组织暴露在大气氧浓度下的情况，这个浓度远高于体内细胞接触到的实际氧气浓度。因此，实际的自由基泄漏速率可能比测量值低好几个数量级。这会造成无法估量的误差，因而得不出一个有意义的实验结果。其次，自由基泄漏不是呼吸作用中不可避免的副产物，而是故意释放的信号；而自由基的泄漏率，在不同物种、不同组织、每天的不同时间、不同的荷尔蒙状态、不同的热量摄取、不同的运动水平之间都存在天壤之别。人在锻炼时会消耗更多氧气，所以自由基泄漏会增高，这么想没错吧？错！它的泄漏水平其实一般都保持不变，甚至会降低，自由基泄漏相对于氧气消耗量的比值会下降很多。原因在于呼吸链中的电子流速度加快，整条路径更加“畅通”，呼吸蛋白复合体的还原态降低，就更不容易与氧气直接发生反应（图36）。具体细节不重要，这里的关键在于：“生命率”与自由基泄漏之间并没有简单清晰的关系。我们介绍过：鸟类的寿命比根据代谢率预测的“应有寿命”长得多；它们的代谢率很快，但自由基泄漏相对很少，活得很长。真正的相关性，其实是在自由基泄漏与寿命长短之间。当然，用相关性来推断因果性是众所周知地不靠谱。但这里的相关性非常显著，它会是因果关系吗？
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图36 为什么不运动不利于健康
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传统的自由基老化理论认为，呼吸链中总有一小部分电子会“泄漏”出来，直接与氧气反应，形成超氧自由基等自由基分子。因为运动时，我们会消耗更多氧气，电子流的流速也更快，所以传统假设认为：即使电子泄漏的比例不变，运动时的自由基泄漏也会增加。但事实并非如此。上图显示运动时的实际情况：因为ATP消耗很快，所以呼吸链中电子流也更快。这让质子从ATP合酶流入，降低膜电位，并让呼吸链可以泵出更多质子补偿，电子流更快地通过呼吸链流向氧气，让呼吸蛋白复合体中很难积聚电子，降低了它们的还原态（浅灰色代表低还原态）。这意味着，运动时人体内自由基泄漏得较少；不运动时的情况恰好相反（下图），自由基的泄漏速率更高。ATP消耗少，膜电位就更高，质子更难泵出，呼吸蛋白复合体中便会逐渐积累电子（深灰色代表高还原态），所以泄漏出更多的自由基。赶紧跑步去吧。
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考虑自由基信号在线粒体中造成的影响：优化呼吸作用，消灭有缺陷的线粒体。自由基泄露得最多的线粒体，也会复制出最多份拷贝，原因在于自由基信号导致增加复制来加强呼吸能力，解决呼吸作用不足的问题。但是，如果呼吸作用不足不是因为能量供求关系的改变，而是因为线粒体和核基因不兼容呢？衰老过程中，一些线粒体确实会发生突变，让细胞中的线粒体种群成为不同类型的混杂，有些与核基因配合较好，有些较差。想想这会带来什么问题。最不兼容的线粒体通常会泄漏最多的自由基，因此自我复制的拷贝会多于其他线粒体。这又会导致两种可能的结果：细胞要么死于凋亡，抹去所有的线粒体突变；要么继续活下去。先看第一种结果。死亡的细胞可能被替换，也可能不被替换。如果发生替换，那么一切正常。但如果死掉的细胞没有接班人，比如脑细胞或心肌细胞的情况呢？这个组织会逐渐流失，留下的细胞数量更少，但需要承担的工作负荷不变，压力就会变大。当细胞处于这种生理压力之下时，数千个基因的活性都会发生变化，如同前面提到的果蝇睾丸线粒体－核兼容性实验。在这个过程的每一个阶段，自由基泄露都没有损坏蛋白质或DNA，也没有造成“错误灾变”。所有变化都由线粒体内部精微的自由基信号传递系统驱动，但最终却导致了组织流失、生理压力加剧，以及基因调控的改变。这些变化都是衰老的表现。
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第二种结果，细胞没有死于凋亡，又会怎样？能量需求不高时，有缺陷的线粒体或者发酵作用（发酵作用产生乳酸，经常被错误地称为无氧呼吸）还可以应付。这种情况下，我们就能在“年迈”的细胞中发现线粒体突变的累积。这些细胞不再正常生长，却可能成为组织中的“刺头”。它们自身承受着生理压力，经常引起慢性发炎和生长因子失调。这会刺激附近本来就有生长倾向的细胞，比如干细胞和血管细胞等，导致它们在不该生长的时候开始生长。如果运气欠佳，它们就会发展成癌症。癌症在绝大多数情况下都与年龄有关。
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值得再次强调的是，整个过程发生都被能量不足驱动，而能量不足又是线粒体中的自由基信号系统所致。不兼容性随着年龄的增长而逐渐累积，会破坏线粒体的正常功能。这与常规的自由基理论完全不同，因为它与线粒体或细胞其他部位的氧化损伤没有关系（当然，这个新理论也不排除氧化损伤的存在，只是没有必要在理论上引入）。如前所述，因为自由基信号的功能是增加ATP合成的信号，据此可以预测，用来阻断自由基的抗氧化剂不会带来什么好处：既无法延年益寿，也无法预防老年病——因为就算它真能到达线粒体，也只会降低细胞的能量供给。这个观点也能解释为什么随着年龄上升，发病率和死亡率都指数级增长。组织的功能会在几十年间缓慢衰退，最终会低于执行正常功能的最低需求。我们会越来越难以应付费力的活动，到最后甚至连静态的生存都无法维持。在人生的最后几十年间，这个过程会在每个人身上重现，让殡葬师的统计图成为指数曲线。
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