1700227601
1700227602
RNA的使用方法与之类似。书的标题相当于由20个碱基排成的序列，我们需要从DNA中找到与该序列互补一致的排序。人类的基因组是由约30亿对碱基排列而成的，每个细胞中都包含着具有30亿对碱基的DNA，所以，需要从中找到与由20个碱基组成的“标题”完全匹配的DNA序列。用“找到”这个词，或许会让人感到奇妙，我们可以想象成碱基相互之间会朝着完全匹配的结合位点移动。虽然相似的序列之间同样存在吸引力，但只要存在吻合度更高的其他位置，碱基就会朝该方向移动，最终必然能找到完全匹配的位点。
1700227603
1700227604
向导RNA会与用来切断DNA双链的Cas 9内切酶形成一个复合体。该复合体被送入想要进行基因操作的细胞内部，找到目标DNA序列，然后由Cas 9执行对DNA的切断。
1700227605
1700227606
1700227607
1700227608
1700227609
■CRISPR‐Cas 9原理
1700227610
1700227611
细胞之中的DNA具有在被切断后进行修复的功能。如果任由其修复成和原序列相同的序列，则CRISPR‐Cas 9会再次发生作用，重复进行切断。因此，必须在反复的“切断—修复”过程中，诱导其发生“修复失误”，令原序列中的碱基发生变化。一旦发生变化，CRISPR‐Cas 9就会停止切断，而发生过“修复失误”的序列则无法再发挥原本的功能。如此一来，就实现了对目标基因的点对点精确破坏（基因敲除）。
1700227612
1700227613
利用这项技术，我们还可以朝瞄准的位点插入新的基因。只要把想导入的新DNA片段与CRISPR‐Cas 9一起传递到细胞内，在基因尝试修复被切断位点的过程中，该DNA片段就会被捕获。把基因切断，然后连接上别的基因，如此这般，就实现了“编辑”。
1700227614
1700227615
如今，RNA属于非常容易制备的材料。第一代和第二代的基因组编辑都是使用蛋白质作为向导的。而第三代CRISPR‐Cas 9则抛弃了蛋白质，只需要准备RNA和Cas 9就足够了，因此操作过程与以往相比，简单了许多。正是这份简单，成为CRISPR‐Cas 9获得迅速普及的原因。
1700227616
1700227617
1700227618
1700227619
1700227620
基因魔剪：改造生命的新技术 [:1700226924]
1700227621
基因魔剪：改造生命的新技术 原则上，基因组编辑能应用于所有生物
1700227622
1700227623
以CRISPR‐Cas 9为核心的基因组编辑技术，被认为能应用于所有生物。研究人员甚至发现，对细胞和病毒也可以进行基因组编辑。
1700227624
1700227625
对于动物，现已确认除人类、猴子和小鼠等哺乳动物之外，CRISPR‐Cas 9对于真鲷、斑马鱼等鱼类，青蛙等两栖动物以及蟋蟀等昆虫同样有效。对于除人类之外的动物，主要是针对受精卵进行基因组编辑。
1700227626
1700227627
在受精卵中引入新DNA片段这一操作本身并不复杂。在第一章我们已经介绍过如何对青鳉的受精卵进行基因组编辑，这一过程需要用到专门用于操作玻璃毛细管的“显微操作器”（micromanipulator）装置。将毛细管插入受精卵，然后注入向导RNA和Cas 9，操作非常简单，大学本科生也能很快掌握。
1700227628
1700227629
而植物的情况则与动物有所不同（本书将在第四章详述）。植物细胞有细胞壁，所以想要将CRISPR‐Cas 9注入细胞内，就会比较困难。因此对于植物，必须先用基因重组技术将向导RNA和Cas 9的表达基因组合到细菌（载体，即用于导入基因的“搬运工”）之中，再把该细菌注入植物细胞内。其中的载体细菌选择的是用于植物基因重组的农杆菌（Agrobacterium）。这也是植物基因重组的常规技术方案。被注入的细菌会在植物细胞内生成向导RNA和Cas 9。
1700227630
1700227631
接着，CRISPR‐Cas 9会在细胞中发挥作用，改变目标基因。对于经过了基因重组的部分，可通过“回交”（backcross）——也就是将其与未经基因重组的植株交配的行为——清除掉。虽然有些麻烦，但这就是目前对植物进行基因组编辑的通用方法。
1700227632
1700227633
最近，为了以物理方式突破细胞壁，研究人员可以使用被称作粒子枪（particle gun）的装置，将附着了基因组编辑工具的金属微粒打入细胞内部。在中国等国家，针对水稻、小麦、大豆以及番茄等作物进行新品种开发的工作已经进行得如火如荼。如何才能将基因组编辑工具以更为简单的方法运送到细胞内部，已成为植物基因重组领域的重大课题。可以预见，一旦克服这个难关，植物基因组编辑技术将再一次发生飞跃。
1700227634
1700227635
无论哪种情况，大前提都是必须知晓DNA的碱基序列。换言之，只要搞清楚了基因序列，就一定能进行基因组编辑。
1700227636
1700227637
另一方面，该技术也存在尚未解决的问题。基因组编辑在理论上应该以目标基因为靶点，但严格说起来，并非所有情况下都能做到只瞄准单一基因，常发生被称作“脱靶效应”（off‐target effects）的现象。一旦除目标基因之外的其他基因遭到改变，则有可能产生无法预料的影响。今后，当该技术被越来越多地应用到医疗领域的时候，或是在讨论食品安全问题的时候，脱靶效应将会成为无法回避的问题。采用什么方法能减少脱靶效应的发生，也将成为重要的技术改进点。
1700227638
1700227639
尽管还存在这样那样的问题，但可以肯定的是，接受过基因组编辑的生物种类正不断增加。生物基因破译技术的快速发展，使其变得简单易行且成本不断降低。在大肠杆菌之外，猪牛之类的家畜、作为宠物的猫犬，以及极具人气的高价稀有观赏鱼类，越来越多的生物已被纳入工业生产体系。除此之外，还有很多以前无法为人类所用的动物，也可借助基因组编辑而衍生出新的利用价值。在当今世界，想要获得成功，靠的是创意。可以预见，未来必将是对各种生物的DNA解析与基因组编辑齐头并进的时代。
1700227640
1700227641
本章对基因组编辑的机制进行了解说。但只看原理，也许会有人觉得这项技术不过如此。的确，它的原理很简单，难免会让人觉得“就这么简单的一回事，为什么从前一直没人想到？”
1700227642
1700227643
简单来说，以前没有人想到的理由在于，在细胞之中，一切绝非如此简单。单独提取一种酶放到试管里，让它发生作用，在这种情况下确实很容易获得符合预期的反应。但在细胞环境下，同时还存在能分解这种酶的其他酶、对DNA起修复作用的酶以及会合成或分解RNA的酶。
1700227644
1700227645
就算知道了原理，想要随心所欲地在细胞内进行操作也是相当困难的。基因组编辑的开发史，就是一部与之对抗的战斗史。CRISPR和Cas 9在哺乳动物的细胞内也能有效地发挥作用，但其他几种被称作“Cas家族”的相似内切酶，却并非都能在哺乳动物的细胞中完成DNA切断功能。不进行实验，就无法预测这种方法是否行得通，细胞中的情况是如此复杂，不可能让操作如臂使指。
1700227646
1700227647
1700227648
1700227649
1700227650
基因魔剪：改造生命的新技术 [:1700226925]