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内科学新进展 [:1700627032]
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内科学新进展 第六节 细菌耐药机制研究概况
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摘 要 抗菌药物的应用日益增多，细菌耐药性问题也日趋严重，已成为全球关注的问题。本文介绍了细菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类以及大环内酯类等临床常用抗菌药物耐药的主要机制。细菌通过产生各种灭活酶、膜通透性下降、靶位改变、外排泵高表达、生物被膜形成等机制造成细菌耐药或多重耐药。
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Abstract With the increasing use of antimicrobial agents, the resistance of antimicrobial agents has become a severe problem in the world. The research progress on resistance mechanism of antimicrobial agents including β-lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, quinolones, and macrolide antibiotics et al were reviewed in this paper, including inactive enzymes production, deceleration of drug permeation, alternation of the drug target, acceleration of efflux pump, bacterial biofilm and so on.
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从20世纪40年代Flemming发现青霉素起，各种抗生素和化学合成抗菌药不断出现，对控制人及畜禽感染性疾病发挥了巨大的作用。但近20年来，随着抗菌药物的广泛应用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。目前抗菌药物耐药产生的速度快于科学家发现新抗菌药物的速度，而抗菌药物的滥用又促进了细菌耐药性的增长。耐药性产生的直接后果是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大了新药的研究与开发成本，因此耐药性问题已经引起人们的广泛关注。
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一种抗菌药物若要有效清除病原菌必须满足3个条件。第一，抗菌药物必须能穿透细菌且以足够的量到达靶位；第二，抗菌药物在与特定的靶位作用之前不能被灭活；第三，细菌中必须存在敏感性靶位。因此，细菌可以通过改变外膜通透性，主动外排使抗菌药物不能到达靶位；产生灭活酶及钝化酶使抗菌药物失活；改变靶位使抗菌药物不能与之结合等机制产生耐药。但一些多重耐药菌株其耐药机制并非独立存在，而是由两种或更多种不同耐药机制共同造成。细菌对抗菌药物耐药主要机制有：
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一、外膜蛋白的缺失或数量的减少
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对革兰阴性杆菌而言，外膜通透性对抗菌药物进出菌体至关重要。革兰阴性细菌细胞壁两侧具有内膜和外膜两层膜，其中内膜结构与真核细胞中的磷脂双分子层生物膜相似，具有很高的流动性；而外膜脂质成分与多数生物膜不同，主要为脂多糖（lipopolysacharide, LPS)。脂溶性药物难以通过细胞外膜。外膜中存在由孔蛋白（porin）组成的充满水的传送通道，这些蛋白质在维持细胞的通透性方面起着重要作用。孔蛋白镶嵌于细胞外膜的脂质层中并和胞外相通，建立起胞内胞外物质交换的通道，能让亲水性物质如β-内酰胺类抗生素通过细菌外膜进入细胞。细菌可通过改变外膜孔蛋白组成和数量比例来改变其通透性。某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”或“固有性耐药”(intrinsically resistant)，即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1％。
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不同的细菌有不同的孔蛋白，目前研究较多的是大肠埃希菌。大肠埃希菌的主要孔蛋白有OmpA、OmpF、OmpC, 另外还有PhoE、LamB。参与药物运输的主要有OmpF和OmpC, 大部分亲水性小分子物质都可经这两种通道进入胞内。目前认为能够通过孔蛋白扩散的抗菌药物除了β-内酰胺类抗生素以外，还有氟喹诺酮类、四环素、氯霉素、氨基糖苷类等。许多氟喹诺酮类药物（分子量为232～400D, 在中性溶液中呈两性离子状态）和β-内酰胺类抗生素都主要通过OmpF进入胞内。OmpF、OmpC均由ompB基因调控。OmpF的低表达或缺失对某些药物的通透性产生明显影响，而OmpC则影响不明显。当OmpF比例增大，膜孔蛋白通透性增加。反之则通透性减低，膜通道关闭。
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细菌在接触抗菌药物后，可使外膜通道蛋白发生非特异性或特异性的改变，使与抗菌药物通透有关的外膜孔蛋白表达减少。OmpF和OmpC均为非特异性蛋白，当OmpF蛋白的基因失活，使OmpF蛋白丢失，结果可使亲水性的β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、氯霉素等抗菌药物不能进入细胞而产生耐药。影响较大的抗菌药物是β-内酰胺类（如D2微孔蛋白丢失造成铜绿假单胞菌耐药）和氟喹诺酮类（大肠埃希菌的OmpF突变株耐药）。引起孔蛋白低表达的突变株都可因药物内流减少而导致耐药性的上升。但是，大肠埃希菌单纯OmpF缺失株对亲水的喹诺酮类抗菌药物的耐药性仅呈两倍的增加，这有可能是由于OmpC代偿性增加的结果。另外，OmpF的表达水平也可受温度、渗透压等环境因素的影响；当温度下降、渗透压降低时，OmpF的表达水平增加。而在高渗、高温环境时，OmpF的表达水平受到明显抑制。
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亚胺培南是通过细菌的OprD孔蛋白（D2)通道进入细胞的，亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌大部分存在OprD（外膜特异性通透蛋白）基因表达的降低或缺陷，使菌株的OprD（D2)通道通透性降低，使亚胺培南无法进入或减少进入菌体，导致耐药。
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OprD耐药的发生需与染色体β-内酰胺酶两种耐药机制并存，根据对阴沟肠杆菌耐药模式的研究，亚胺培南的MIC取决于进入胞质的抗菌药物分子数目与被β-内酰胺酶所抑制的药物分子数目之差。铜绿假单胞菌的耐药机制也可能如此。
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孔蛋白本身的功能状态的变化也可影响其通透性。研究表明，孔蛋白在生理状态下，一般处于两种功能状态，开放状态和关闭状态，多氨基物质能使之关闭。细菌可随外界渗透压的变化产生不同程度的多氨基物质，从而调节孔蛋白的功能状态。但如何来实现这种调节目前尚不清楚。
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总而言之，外膜屏障在细菌耐药过程中起着重要作用。Omps是维系细胞内外小分子亲水性物质交换的通道，Omps的减少或缺失使细菌耐药性大大增强。进一步研究其调控机制将有助于耐药机制的最终阐明。
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二、产生灭活酶或钝化酶
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细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性。目前，细菌产生的灭活酶主要有β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和MLS（大环内酯类—克林霉素类—链阳菌素类）类钝化酶，其中最重要的是β-内酰胺酶。
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1．β-内酰胺酶
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β-内酰胺酶是一类由细菌产生的能够降解β-内酰胺类抗生素（如青霉素类，头孢菌素类，碳青霉烯类抗生素等），使其抗菌活性减弱或消失的酶。至今，已发现β-内酰胺酶有四百多种，目前普遍采用的分类方法有两种：一种为分子生物学的分类，根据末端氨基酸序列及编码基因的位点来分，可分为四类：A类，为丝氨酸酶，由质粒编码；B类，为金属酶，由染色体编码；C类，为丝氨酸酶，由染色体编码；D类，为丝氨酸酶，由质粒编码。另一种为临床上较为实用的分类方法，即1995年Bush等的分类方法，此分类方法是根据各种酶的等电点、水解底物、是否被克拉维酸抑制及酶的分子结构类别来分，主要分成四类：Ⅰ类：由染色体编码的头孢菌素酶，不能被克拉维酸抑制；Ⅱ类：通常可被克拉维酸抑制，根据对各种β-内酰胺类抗生素的优先水解顺序分为6个亚组；Ⅲ类：金属β-内酰胺酶，含有活性位点锌而不是丝氨酸，水解底物广（包括亚胺培南）；Ⅳ类：主要由染色体编码、耐酶抑制剂的青霉素酶。β-内酰胺酶的分类方法和特点见表9-10。
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表9-10 β-内酰胺酶的分类方
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在革兰阳性菌中β-内酰胺酶较为简单，只有两种：青霉素酶和头孢菌素酶，研究的人较少。革兰阴性菌β-内酰胺酶种类较为复杂，几乎所有的肠杆菌科细菌其β-内酰胺酶均阳性。Jacoby和Bush等学者建立了各类β-内酰胺酶的网站（http://www.lahey.org/studies/webt.htm.)。截止2008年11月18日，共发现近400余种β-内酰胺酶，其中TEM型约170余种，SHV型约110余种，CTX-M型82种，OXA型有135种，以及其他基因型（www.Lahey.org/studies/)。其中超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶愈来愈受到重视。
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（1）超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs) ESBLs是由质粒介导的能水解氧亚氨基β-内酰胺抗生素，并可被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸等抑制的一类β-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。根据2001年Bradford的分类方法，将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型、其他型五类。此类酶不仅可水解青霉素类和第一、第二、第三代头孢菌素，还能水解单酰胺菌素（如氨曲南 aztreonam），甚至第四代头孢菌素；但含有7-α甲基侧链的头霉素类如头孢西丁、头孢替坦等相对稳定。除了TEM-50，68同时具有ESBLs和IRT（耐酶抑制剂）的特点外，其余的ESBLs都能被克拉维酸、舒巴坦所抑制。各类型的ESBLs最优化的底物各不相同。ESBLs主要由克雷伯菌属、大肠埃希菌和奇异变形杆菌产生，也可由其他肠杆菌科细菌、不动杆菌以及铜绿假单胞菌产生。对产ESBLs细菌引起的感染，碳青霉烯类抗生素如亚胺培南／西司他丁、美罗培南等疗效最确切；复合制剂如头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／三唑巴坦也有较好的疗效。头霉素类，如头孢西丁、头孢替坦等，治疗成功率相对较低，最多只有70％。环丙沙星、阿米卡星等必须根据药敏结果选择。
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（2）AmpC酶（头孢菌素酶） AmpC酶（头孢菌素酶）最初是在氨苄西林耐药大肠埃希菌中发现的一种染色体编码的β-内酰胺酶，并且根据其耐药性而命名。因其水解的优先底物是头孢菌素，故又称头孢菌素酶。而现在AmpC酶的概念有了很大的拓展，它代表由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家族，属β-内酰胺酶Bush分类中1类酶，它们在分子结构上具有同源性，都属于分子分类中的C类。AmpC酶存在于大多数肠杆科细菌和铜绿假单胞菌中，分为诱导酶和非诱导酶两类，诱导性AmpC酶存在于肠杆菌、柠檬酸杆菌、普罗威登斯菌、不动杆菌、黏质沙雷菌、小肠结肠炎耶耳森菌、摩氏摩根菌以及铜绿假单胞菌等，可被青霉素类和头孢菌类抗生素诱导；非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺菌、克雷伯菌等，其表达不受β内酰胺类抗生素和其他外部因素的影响，但具有代谢调节性。AmpC酶的表达受amp复合操纵子调控，amp操纵子由4个不连锁基因即ampC、ampR、ampD和ampG组成，ampC是AmpC酶的结构基因；ampR编码诱导性转录调控因子；ampD编码一种新的N-乙酰葡糖胺-L丙氨酸酰胺酶；ampG编码膜结合转运蛋白；目前研究发现，AmpC酶出现由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移趋势，大大提高了AmpC酶的横向传播能力。对于产AmpC酶细菌的感染的治疗可以选择的抗菌药物有：第四代头孢菌素；碳青霉烯类抗生素；对其敏感的非β-内酰胺类抗生素（如氨基苷类、喹诺酮类）；常规的青霉素类、第一、二、三代头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺抗生素合剂往往对该类细菌无效。
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（3）碳青霉烯酶 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。其中B类为金属酶，在Bush分群中为第三组，可由染色体、质粒或转座子介导，由后者编码的获得性金属酶可见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌；A类、D类为丝氨酸酶，属于Bush分群中的2f和2d亚组，A类酶目前主要见于一些肠杆菌科细菌，D类酶主要见于不动杆菌。碳青霉烯类抗生素水解酶包括：①分类属于2f型的A类酶，具有丝氨酸位点，A类碳青霉烯酶较少见。它包括阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1-2酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1、KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-5酶、铜绿假单胞菌中GES-2、GES-3、GES-4、GES-5酶，居泉沙雷菌的SFC-1酶。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3早在碳青霉烯类抗生素应用于临床之前就已存在，是天然来源的碳青霉烯酶。A类碳青霉烯酶都是青霉素酶，对亚胺培南的水解活性强于美罗培南，可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3不能水解三代头孢菌素，IMI-1、NmcA能被克拉维酸抑制，而Sme-1-3则不被抑制。②分类属于3型的B类酶，也叫金属酶，金属酶不仅对β-内酰胺酶的抑制剂敏感性差，而且能够水解包括碳青霉烯类抗生素（carbapenems）在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素。金属酶分别属于功能分类的Ⅲ类酶和分子生物学分类的B类酶。按水解底物的不同，金属酶分为3组功能亚群3a、3b、3c。3a组金属酶作用底物最广，包括青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素，但氨曲南例外，对头孢菌素类的水解速度通常比碳青霉烯类慢。3b组金属酶主要包括来自气单胞菌属的金属酶CphA/CphA2、ACP、ImiS、AsbM1、ASA-1、A2h以及洋葱伯克霍尔德菌、芳香黄杆菌的金属酶，特别易于水解碳青烯类抗生素，但并不导致青霉素、头孢菌素耐药，属于真正意义上的碳青霉烯类酶。多数金属酶被EDTA抑制后加入Zn2+能恢复活性，但至少有3种来自3b组的酶ACP、AsbM1、ASA-1的活性能被低浓度的Zn2+（≤15μm）抑制。3c亚群目前只包括来自军团菌的金属酶，主要水解头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素。多数金属酶对亚胺培南的水解能力强于美罗培南，但也有例外，蜡样芽孢杆菌Ⅱ酶和3b中的AsbM1对美罗培南的水解能力更强。金属酶对氨曲南的水解能力都很弱。根据氨基酸的同源性，Bush又把金属酶分成三组结构亚型B1、B2、B3。已知的获得性金属酶主要包括IMP、VIM、SPM-1、GIM和SIM型金属酶，都属于B1亚型。只有SPM-1较特殊，是B1亚群和B2亚型的混合体。这些酶不仅存在于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，还可以通过整合子、转座子或质粒等进行水平扩散。最近，澳大利亚学者从铜绿假单胞菌中分离出一种新的金属酶，命名为AIM-1。③D类β内酰胺酶，又称OXA酶，在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，Vmax是水解青霉素的1％～3％，其耐药性的表达有赖于膜透通性降低的协同作用，对苯唑西林的Vmax是青霉素的两倍，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其他酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力。由于产碳青霉烯酶细菌耐药机制比较复杂，目前尚无可以高效控制该类产酶菌感染的药物，临床治疗方案还需依赖药敏结果进行制定。单环酰胺类、环丙沙星、庆大霉素对部分产酶株有活性。对于产OXA型碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌，可选用含舒巴坦的复合制剂如头孢哌酮／舒巴坦等，产A类酶菌株可选用第三代头孢菌素。值得注意的是，部分携带碳青霉烯酶基因的菌株对碳青霉烯类抗生素表型敏感，其原因可能是：①沉默型基因的存在；②质粒拷贝数较少，对碳青霉烯类抗生素水解率较低。这种情况下也不宜应用碳青霉烯类抗生素，容易诱导碳青霉烯酶高水平表达。
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2．氨基糖苷类抗生素钝化酶
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