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1700638270 液相芯片是近年才发展起来的新方法，是基于Luminex xMAP system的一个多功能生物芯片分析平台，整合了编码微球、激光技术、应用流体学、高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、灵敏度高、速度快等特点。笔者采用液相芯片技术可同时达到对几十种HPV亚型的检测，发现该技术比反向点杂交的多重感染阳性检出率明显要高。由于检测成本和费用也相对便宜，不仅可以进行临床筛查，还对大范围的流行病学调查及HPV疫苗的研究提供可靠资料。

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1700638272 2．肝炎病毒的检测

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1700638274 应用核酸杂交和PCR检测急性甲肝和急性戊肝患者粪便中的HAV或HEV已有较多报道。乙型肝炎病毒（HBV）感染的诊断，主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBsAg, HBeAg, 抗－HBs, 抗HBc及抗HBe的存在，免疫测定法简单易行，重复性好，具有重要的临床价值，但其测定的是病毒的蛋白成分和机体产生的相应抗体。基因诊断可直接测定该病毒核酸，其中PCR法可测到1/100000pg的HBV DNA。此外，在一些特定的情况下，PCR技术已显示其独特的优越性，如：①当病毒基因组发生变异时，免疫测定可为阴性而PCR仍可检出；②应用PCR可对患者血中HBV浓度进行粗略定量而对临床治疗及预后判断具有重要意义；③适用于病毒滴度很低的临床标本检测；④用于考核抗病毒治疗效果及检测基因耐药性突变；⑤明确HBV复制状态及传染性；⑥在HBV与原发性肝癌关系的研究等。时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）定量测定乙肝五项指标的相对特异性、灵敏度及符合率较ELISA法要高。另外，基于PCR扩增HBV逆转录酶的编码基因后进行直接测序分析的检测方法，较限制性片段长度分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP)，具有准确度高、特异性和重复性好等特点。而近期，有学者报道采用微流控基因芯片来检测HBeAg（—）感染者血清前C区及BCP热点变异。

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1700638276 基因诊断在丙型肝炎病毒（HCV）的研究中同样具有特别重要的意义，HCV是近年才发现的一种单链正肽RNA病毒，丙肝多因输血或血制品而引起，临床预后较差，死亡率较高。发达国家的输血后肝炎的90％～95％属于这一类。在输血者中还存在无症状的HCV携带者。自1989年克隆和序列分析HCV成功后，应用重组抗原和人工多肽抗原为基础的抗HCV检测技术得以发展并不断完善。但由于血清转化需要较长的迟滞期，并有相当部分病人由于机体免疫或病毒变异等各种原因，始终测不出抗HCV。此外，由于所检测的IgG抗体在机体内存在时间较久，故无法区分患者是现症感染还是既往感染。由于HCV在血液中的含量很低，难以用核酸杂交等方法直接检出，而PCR检测具有极高的敏感性和特异性，可从极低病毒含量的肝脏和血标本中检测出HCV特异序列。荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）则是目前检测HCV RNA的最佳手段，其采用实时检测技术连续不断地检测PCR过程中反应体系对荧光信号的变化，利用荧光信号达到某一阈值时的循环次数与起始模板DNA量的对数值之间的严格线性关系，进行起始模板定量，可真实反映HCV的复制情况。因此，在HCV感染的预防、诊断及疗效判断等方面，无疑起着重要的作用。

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1700638278 3．HIV的检测

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1700638280 艾滋病是严重威胁人类生命的疾病之一，由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起。由于HIV-DNA序列可整合到宿主基因组中，因此在相当长的时期内HIV处于潜伏状态。整合的HIV-DNA以很低的拷贝数存在，故需要用非常敏感而又特异的方法进行检测和研究。目前用于HIV的检测方法很多，包括病毒体外培养法、逆转录酶法、外周血中抗原直接测定等。这些方法费时、费力、稳定性较差。原位杂交可直接检测有逆转录活性的细胞内病毒核酸；Southern印迹法可同时对淋巴细胞中的HIV-DNA进行分析；PCR技术敏感、特异，为AIDS病的诊断及研究提供了有力的手段。这些基因诊断技术可用于追踪HIV的自然感染史，可在其他血清学和病毒学标志出现前检出HIV序列。因此可用于判定无症状且血清学检测阴性患者潜在的HIV传播的可能性，并可用于监测长潜伏期（4～7年）的患者。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，由于存在母体抗体的干扰，基因诊断可判定婴儿是否真正被HIV感染。采用抗体检测法在普通门诊监测艾滋病病毒感染，虽然快速方便，但存在较长的窗口期，容易漏诊。而制备Au纳米颗粒HIV cDNA基因探针，通过液相杂交技术检测HIV cDNA, 可以缩短检测窗口期，做到早期诊断和预防。此外，基因诊断在血制品的检测中也发挥重要作用。PCR-微流芯片法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好特点，可应用于血液HBV DNA/HCV/HIV RNA的筛查工作，以进一步提高输血的安全性。

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1700638282 4．结核杆菌的检测

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1700638284 以前主要依靠痰涂片镜检抗酸杆菌和结核杆菌的培养与鉴定。但痰涂片阳性率不高，且不能确诊，而抗酸杆菌培养又需要较长的时间。目前已建立了该菌的基因诊断方法，如Hance等先用PCR技术扩增出一383bp序列，再用探针杂交，敏感度达到可检出100个细菌的水平。Eisenach等利用结核杆菌染色体中一群特异性重复序列设计的引物用PCR扩增出123bp片段。如进行30个循环，敏感性可达到10fg。由于该保守的特异性重复序列在结核杆菌染色体内有多个拷贝，因此即便某些结核菌株发生变异，只要它保留一个重要序列拷贝就能保证扩增的准确性。而通过PCR-SSCP法检测结核分支杆菌L型rpsL耐药基因，发现其突变与结合杆菌耐受链霉素密切相关。近年，有报道将单侧延长臂分子信标探针设计自然运用到芯片技术上，具有良好的检出率、特异性与敏感性，可直接对结核分支杆菌核酸分子进行特异性检测。另外，蛋白芯片技术具有简便、快速、敏感性高、特异性强和检测成本较低的特点，是结核病辅助诊断的有效方法。

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1700638286 5．淋球菌的检测

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1700638288 由于淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要依靠实验室检查。传统的临床标本涂片染色在中性粒细胞内寻找革兰氏阴性双球菌检查方法，简便易行，但敏感性不高，也不能确诊。淋球菌的分离培养对营养要求较高，生化鉴定复杂，需要较长时间，难以满足临床需要。基因诊断直接鉴定淋球菌，在时间上明显缩短，且更为敏感，故是一种快速、敏感且特异检测淋球菌的新方法。当然，该法尚需广泛的临床考核验证，从根本上取代传统的分离培养法还有待于进一步的研究。根据淋球菌的基因保守序列设计引物和探针，通过制备基因芯片，结合多重PCR技术可检测淋球菌及其对抗生素的耐药性。有文献报道芯片检测结果与目前的临床检查结果具有较好的一致性。

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1700638290 6．幽门螺杆菌的检测

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1700638292 大量的临床和流行病学资料均提示，幽门螺杆菌（HP）感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌的发生也有密切的关系。随着分子生物学技术的发展，其在HP感染研究中的应用越来越广泛。1988年，研究者最早采用斑点膜杂交法将幽门螺杆菌HP基因组探针用于HP检测。后来有学者报道，PCR可扩增仅一个靶拷贝的HP质粒DNA, 与寡核苷酸探针相比，其灵敏度至少高出100倍。而用套式PCR可合成与扩增产物内部序列互补的寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交，可使灵敏度提高10倍，即使低至1个细菌的靶DNA也能检出。此外，用套式引物双扩增或同时在引物扩增序列内选择寡核苷酸作探针，对PCR扩增产物进行Southern blot检测，可使敏感性增加10～100倍，可检出难以培养的球形HP。因此，以前对某些用常规方法不能检出而实际还存在HP的病人，往往会被误认为HP已根除而放弃治疗，而在实际临床诊断过程中采用PCR等较高灵敏度的手段来进行检测分析就显得尤为重要。

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1700638294 7．人类寄生虫的检测

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1700638296 钩端螺旋体可引起危害野生动物、家禽和人类的传染性疾病。由于其临床症状多样且不够典型，故既往主要依靠实验室ELISA或显微镜凝集诊断试验为准，但一般要8～10d病人才出现抗体。钩体培养可确诊此病，但费时较长，实验上只能作为回顾性诊断。分子生物学方法，尤其是PCR技术是检测钩体的敏感而且快速特异的方法，有助于早期诊断。但通常某些螺旋体之间存在交叉反应，如不能区分腐生的双曲钩端螺旋体和致病的钩端螺旋体。鉴于临床标本中通常无双曲钩端螺旋体存在，故实际应用时影响不大。而对于梅毒螺旋体的检测，目前所用的标准方法是放射免疫感染试验（RIT)，但该法在临床常规应用并不现实。血清学诊断时确定感染及治疗很有意义，但缺乏早期诊断价值。并且母亲的IgG型抗体可传给胎儿，故对先天性及神经性梅毒的诊断也不够特异。应用PCR法可快速敏感地检测梅素螺旋体。另外，对于其他一些寄生虫，通常采用血涂片或光学显微镜及免疫学方法可获得比较满意的结果。但是，光镜检查费时费力，难以胜任现场大量标本检测的要求，有时也可能发生漏检。用免疫学方法检查抗体虽较灵敏，但不能鉴别以往感染还是现行感染，这对于决定治疗方案及预后极为不利。因此近年来，寻找更加灵敏、特异和简便的检测抗原的方法受到普遍重视，DNA诊断技术从这些传统的检测方法中脱颖而出并逐步显示出其强大的优势，现正被推广应用。

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1700638298 三、基因治疗的研究进展

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1700638300 所谓基因治疗，就是用正常或野生型基因置换致病基因以纠正基因结构和功能异常的一种治疗疾病的方法。狭义的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主基因组的一部分，目的基因的表达产物起治疗疾病的作用。而广义的基因治疗则包括通过基因转移技术或反义核酸技术、核酶技术等，使目的基因得到表达，或封闭、剪切致病基因的mRNA, 而达到治疗疾病的目的。

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1700638302 基因治疗目前已试用于许多疾病，国内外学者已经在体内、外进行了许多项目的尝试，研究了各种基因转移的方法，努力寻找更加安全、有效的实施方案。人类基因组计划的实施，使我们能够逐渐掌握人体内的所有遗传信息，使基因治疗的前景更为广泛。将来，基因治疗技术不仅可用于治疗，还可以用于预防许多疾病。基因治疗大致用于三方面疾病：遗传病，肿瘤和病毒感染。

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1700638304 1．遗传性疾病

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1700638306 根据疾病的发病机理确定目的基因，如β地中海贫血是由于β珠蛋白基因的点突变和（或）基因缺失，形成β链mRNA功能丧失或表达异常的血红蛋白，从而引起地中海贫血的临床表现。因此，对该病的基因治疗就要导入正常β珠蛋白的基因。β珠蛋白基因族庞大，调控非常复杂，除β珠蛋白基因组外，其上游基因调节元件即位点调控区（locus control region, LCR）的DNase敏感（hypersensitive, HS）片段（包括HS2、HS3、HS4）对转导后的基因表达非常重要。骨髓干细胞是β地中海贫血基因治疗较为理想的靶细胞。多年来应用逆转录病毒载体（常用癌瘤逆转录病毒，onco-retroviral vector）将正常β珠蛋白基因转入骨髓干细胞（或红细胞）中表达正常的β珠蛋白链，替代患者的异常基因，从而达到治疗的目的。采用癌瘤逆转录病毒载体将人珠蛋白基因导入小鼠红白血病（MEL）细胞进行培养，可成功表达β珠蛋白。但由于载体的容量有限（仅7kb左右），无法完全包含β珠蛋白基因组及其上游LCR片段，故表达效价低且不稳定。因此，近年广泛开展慢病毒（lentivirus）基因载体作为β地贫基因治疗的研究。此载体容量大，可以保证β珠蛋白基因的高效、稳定表达；同时可以转染静止期细胞，并能永久表达。常用的是HIV-1为基础的慢病毒载体。

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1700638308 血友病是一种性连锁的隐性遗传病。病因是凝血因子基因缺陷造成某种凝血因子的缺乏或不足。按照缺失的凝血因子种类，血友病可分为甲、乙、丙三型，其缺乏的凝血因子种类分别是Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ。血友病的传统治疗方法为静脉输入纯化的FⅧ，虽然可以有效纠正临床症状，但有感染人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等危险。因此，基因治疗血友病是一种有效的可供选择的治疗手段。国内复旦大学遗传学研究所薛京伦等自1987年起开展血友病乙基因治疗实验研究，构建了数个带有人凝血因子Ⅸ cDNA的载体，转入皮肤成纤维细胞，取得了迄今国际上动物体内外表达人凝血因子Ⅸ水平最高、持续时间最长的结果。在此基础上，该单位和第二军医大学附属长海医院合作，自1991年8月起，开始了以皮肤成纤维细胞为靶细胞的血友病乙基因治疗临床研究。将逆转录病毒载体和人凝血因子Ⅸ cDNA的重组体用细胞悬液的方式皮下注射，共治疗2例病人。随访结果表明，未发现与基因治疗相关的毒副作用，血浆内Ⅸ因子水平增高1～3倍，至少可持续表达16个月以上，患者临床症状有所改善。凝血因子Ⅷ由于基因分子量巨大，现有各种基因治疗的载体的装载能力都无法胜任，有关研究人员正在探索改造凝血因子cDNA的结构，并取得可喜的进展。目前国际上关于血友病基因治疗的临床实验正在如火如荼地展开，GenStar公司研制的MAX-ADFⅧ腺病毒载体由1种普通的感冒病毒改造而成，该载体中所有与递呈病毒相关的基因都被编码FⅧ的基因所替代，目前MAX-ADFⅧ已进入临床试验阶段。

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1700638310 苯丙酮酸尿症是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。其中98％～99％是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase, PAH）基因突变导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏所致，1％～2％是由于苯丙氨酸羟化酶的辅酶四氢生物蝶呤缺乏，导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而苯丙氨酸在体内异常蓄积并打破大脑氨基酸的平衡而致病。由于正常情况下该酶主要在肝内产生，因此该病的基因治疗主要以肝细胞作为靶细胞。目前将该酶基因导入人肝细胞的研究已经取得了成功。

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1700638312 囊性纤维化病（CF）是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，黄种人中较为少见。由于基因突变导致囊性纤维跨膜通道调节因子（DFTR）蛋白缺馅，影响外分泌腺导管上皮对氯离子的通透性，使得大量黏液阻塞全身外分泌腺而导致慢性阻塞性肺疾病和胰腺功能不全。目前，有人设计了利用腺相关病毒重组CFTR基因导入呼吸道上皮细胞，但是表达量比较低，以后发现在黏膜下腺中CFTR的表达量很高。但由于黏膜下腺体细胞难以用呼吸道感染途径进行基因转移，所以呼吸道黏膜仍作为重要靶细胞而被选用。

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1700638314 2．肿瘤的基因治疗

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1700638316 长期以来，各种肿瘤性疾病严重威胁着人类的健康和生命，目前主要用外科手术，化学治疗，放射治疗和生物治疗四种方式。上述方法在人类治疗肿瘤性疾病中都起到了重要的作用。抗肿瘤基因治疗以基因修饰和基因失活两种方法最为常用。多数情况下，肿瘤患者处于免疫耐受状态，因此，将能提高机体免疫应答水平的基因导入患者体内，将有利于患者免疫力的提高，采用反义技术如反义核酸、核酶等抑制癌基因的表达、将野生型抗癌基因导入患者肿瘤细胞或非肿瘤细胞，抑制肿瘤的恶性生长，引导恶性肿瘤细胞的正常转化，都是肿瘤基因治疗的基础方法。近年来，肿瘤的基因治疗研究发展非常迅速，许多项目已经进入临床应用阶段。

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1700638318 细胞因子的转基因治疗比较成熟，基本原理是以过继免疫疗法为基础，将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强，并以免疫效应细胞为载体细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。已有文献报道的主要有干扰素类、白细胞介素类、克隆刺激因子类、肿瘤坏死因子及转化生长因子。干扰素可分为α、β、γ三种类型。抗肿瘤治疗时主要选择γ干扰素。将γ干扰素基因转入肿瘤细胞使肿瘤细胞的致瘤性发生改变。研究表明，γ干扰素的局部分泌，可以诱导很强的抗肿瘤免疫应答。白细胞介素是体内重要的免疫效应分子，在肿瘤免疫中发挥重要作用。用白细胞介素基因导入靶细胞的疗法主要有两种：①导入肿瘤细胞，使之丧失致瘤性，同时增强肿瘤的免疫原性，起所谓“肿瘤疫苗”作用。其分泌的细胞素，可以原位激活CTL作用，协助杀灭肿瘤细胞。②导入TIL进行过继免疫疗法，增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的抗瘤活性。TIL能浸润到肿瘤组织中，如向TIL转移细胞因子基因，可在肿瘤局部释放高浓度细胞因子，从而增强该微环境对癌细胞的杀伤作用，同时避免全身大剂量使用白介素，TNF等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已使用的细胞因子种类很多，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF和G-CSF等，所针对的肿瘤包括恶性黑色素瘤、肾癌、肺癌、结直肠癌等。Rosenberg等经NIH批准开展用TNF基因治疗黑色素瘤的临床实验，其中1例存活已超过9个多月，其余还在观察之中。Ren等将IL-12基因用塞姆利基森林病毒（SFV）包裹，并将这种包裹体用于多形性恶性胶质瘤的治疗，结果显示在48～72h内就能诱导肿瘤细胞的凋亡，而且这种包裹体表现出了很好的生物安全性。美国Shgawler等将IL-2基因用反转录病毒载体分别导入BALB/c3T3成纤维细胞和结直肠癌细胞，然后转入到人结直肠癌的动物模型中，发现无论是诱导肿瘤免疫性还是原位杀灭肿瘤细胞，前者都占有优势，具有良好的效果。另外一种思路是将细胞因子的受体基因导入肿瘤细胞。如Isobe等用反转录病毒将控制TNF受体的基因转染人结肠癌细胞中，使之表达TNF的受体蛋白，当使用TNF时，这些转染了TNF受体的肿瘤细胞很容易就被杀灭。这是肿瘤基因治疗的一种新方法。

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