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1700638312 囊性纤维化病（CF）是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，黄种人中较为少见。由于基因突变导致囊性纤维跨膜通道调节因子（DFTR）蛋白缺馅，影响外分泌腺导管上皮对氯离子的通透性，使得大量黏液阻塞全身外分泌腺而导致慢性阻塞性肺疾病和胰腺功能不全。目前，有人设计了利用腺相关病毒重组CFTR基因导入呼吸道上皮细胞，但是表达量比较低，以后发现在黏膜下腺中CFTR的表达量很高。但由于黏膜下腺体细胞难以用呼吸道感染途径进行基因转移，所以呼吸道黏膜仍作为重要靶细胞而被选用。

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1700638314 2．肿瘤的基因治疗

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1700638316 长期以来，各种肿瘤性疾病严重威胁着人类的健康和生命，目前主要用外科手术，化学治疗，放射治疗和生物治疗四种方式。上述方法在人类治疗肿瘤性疾病中都起到了重要的作用。抗肿瘤基因治疗以基因修饰和基因失活两种方法最为常用。多数情况下，肿瘤患者处于免疫耐受状态，因此，将能提高机体免疫应答水平的基因导入患者体内，将有利于患者免疫力的提高，采用反义技术如反义核酸、核酶等抑制癌基因的表达、将野生型抗癌基因导入患者肿瘤细胞或非肿瘤细胞，抑制肿瘤的恶性生长，引导恶性肿瘤细胞的正常转化，都是肿瘤基因治疗的基础方法。近年来，肿瘤的基因治疗研究发展非常迅速，许多项目已经进入临床应用阶段。

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1700638318 细胞因子的转基因治疗比较成熟，基本原理是以过继免疫疗法为基础，将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强，并以免疫效应细胞为载体细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。已有文献报道的主要有干扰素类、白细胞介素类、克隆刺激因子类、肿瘤坏死因子及转化生长因子。干扰素可分为α、β、γ三种类型。抗肿瘤治疗时主要选择γ干扰素。将γ干扰素基因转入肿瘤细胞使肿瘤细胞的致瘤性发生改变。研究表明，γ干扰素的局部分泌，可以诱导很强的抗肿瘤免疫应答。白细胞介素是体内重要的免疫效应分子，在肿瘤免疫中发挥重要作用。用白细胞介素基因导入靶细胞的疗法主要有两种：①导入肿瘤细胞，使之丧失致瘤性，同时增强肿瘤的免疫原性，起所谓“肿瘤疫苗”作用。其分泌的细胞素，可以原位激活CTL作用，协助杀灭肿瘤细胞。②导入TIL进行过继免疫疗法，增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的抗瘤活性。TIL能浸润到肿瘤组织中，如向TIL转移细胞因子基因，可在肿瘤局部释放高浓度细胞因子，从而增强该微环境对癌细胞的杀伤作用，同时避免全身大剂量使用白介素，TNF等细胞因子所引起的严重毒副反应。目前已使用的细胞因子种类很多，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF和G-CSF等，所针对的肿瘤包括恶性黑色素瘤、肾癌、肺癌、结直肠癌等。Rosenberg等经NIH批准开展用TNF基因治疗黑色素瘤的临床实验，其中1例存活已超过9个多月，其余还在观察之中。Ren等将IL-12基因用塞姆利基森林病毒（SFV）包裹，并将这种包裹体用于多形性恶性胶质瘤的治疗，结果显示在48～72h内就能诱导肿瘤细胞的凋亡，而且这种包裹体表现出了很好的生物安全性。美国Shgawler等将IL-2基因用反转录病毒载体分别导入BALB/c3T3成纤维细胞和结直肠癌细胞，然后转入到人结直肠癌的动物模型中，发现无论是诱导肿瘤免疫性还是原位杀灭肿瘤细胞，前者都占有优势，具有良好的效果。另外一种思路是将细胞因子的受体基因导入肿瘤细胞。如Isobe等用反转录病毒将控制TNF受体的基因转染人结肠癌细胞中，使之表达TNF的受体蛋白，当使用TNF时，这些转染了TNF受体的肿瘤细胞很容易就被杀灭。这是肿瘤基因治疗的一种新方法。

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1700638320 MHC抗原基因的转基因疗法是利用肿瘤细胞逃避机体免疫系统的一种机制，由于其不表达MHC-Ⅰ类抗原而不能被免疫系统所识别。于是，有人设计了将MHC-Ⅰ类分子的基因（如HLA-B7，HLA-B27等）原位导入缺乏MHC-1抗原表达的肿瘤细胞中，诱导产生肿瘤特异性的细胞毒作用来杀灭肿瘤。James等将MHC-Ⅱ基因导入K36.16肿瘤细胞，使肿瘤细胞充当APC的角色，将肿瘤抗原递呈给CD4+Th细胞，激活细胞免疫，结果肿瘤细胞的生长受到抑制。Hui等用转MHC-Ⅰ基因肿瘤疫苗免疫AKR鼠，结果在接种处肿瘤细胞不能生长，说明了肿瘤疫苗提高了肿瘤细胞的免疫原性，增强了机体的抗肿瘤应答能力。现在MHC基因治疗已经进入了临床实验，表现出了良好的临床应用前景。

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1700638322 （1）抗癌基因的导入治疗　抗癌基因（Antioncogene)，又称抑癌基因（Tumor Suppressor Gene)，根据其功能，该基因又可分为控制细胞增生的看门基因（gate keeper gene）和维持基因完整的看管基因（care taker gene)。由于许多恶性肿瘤中都有抗癌基因的变异、缺失或失活，在肿瘤发生发展中起重要作用。因此用替代或添加的方法将某些含有抗癌基因的染色体片段或整条染色体臂导入那些抗癌基因缺乏的肿瘤细胞中，恢复其抗癌功能，是一种许多研究人员都感兴趣的基因治疗思路。目前已经克隆的抗癌基因中，P53基因的研究较为透彻。据报道，在大约200多种不同的肿瘤中，有50％的肿瘤带有P53基因突变。已发现P53基因中有4个位于外显子5～8的突变热点，虽然不同组织器官发生的肿瘤中，P53基因突变谱显示有差异，但约有90％的突变是集中在这部分区域。目前研究最多的是以正常的野生型P53基因的替代疗法，此方法主要是通过转基因技术将野生型P53基因整合到恶性肿瘤的基因组中去，以替换肿瘤细胞中突变的P53基因。动物实验表明应用逆转录病毒，腺病毒等载体将野生型P53基因导入P53基因突变的肿瘤细胞中，可引起癌细胞凋亡，并且丧失致瘤性。由于癌症是多基因突变协同作用的结果，有研究者还将野生型P16基因导入神经胶质瘤的肿瘤细胞内，临床治疗实验表明，导入P16基因的肿瘤细胞的生长停止在G0-G1期之间。应用野生型P21基因导入前列腺癌小鼠模型，发现其能明显抑制肿瘤细胞的生长。

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1700638324 （2）抑制癌基因的表达　癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。这种基因在人的正常细胞中就已存在。在绝大部分情况下，这类潜在的癌基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用。但是当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。如Ras、Myc、Src等基因，由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传导途径，促使细胞异常生长。因此采用反义核苷酸序列在癌基因表达时与mRNA特异性结合，阻断癌基因的表达，是恶性肿瘤基因治疗的重要方法之一。目前在这方面已经进行了较多的临床前研究。如应用C-myc反义核酸治疗食管癌，C-kit、C-myb的反义核酸治疗白血病，K-ras反义核酸治疗直肠癌和肺癌，N-ras反义核酸治疗肝癌等，尽管效果尚不满意，但积累了不少有益的经验，其中用K-ras基因治疗非小细胞肺癌（NSCC）的方案已于1993年经NIH批准进行临床实验。

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1700638326 核酶（ribozyme）是一类具有RNA酶活性的RNA, 由三个部分组成，中间是酶活性中心，两侧为可与靶RNA特异性结合的序列，是构成活性基因的必需成分。它与靶RNA链结合后能使其在特定部位断裂，达到降解靶RNA的作用，而核酶本身并不被消耗，又能与另一个靶RNA结合，因此工作效率非常高。反义核酸与靶mRNA结合时，每封闭一个靶分子，就要消耗一分子的反义核酸，核酶只是催化靶mRNA断裂，而自身却没有消耗。在当代生物医学领域，利用核酶技术进行肿瘤的基因治疗已成为一项重要手段。肿瘤的生长和转移依赖于血管的生成，血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤相关性血管形成的重要诱发因子之一，因此，用抗VEGF的锤头状Rz或发夹样Rz来抑制VEGF的表达，可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。Tokunaga等将抗VEGF189的核酶转染到胰腺癌细胞系MIA PaCa2，结果表明，抑制VEGF的水平能有效抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移。Ciafrè等针对VEGF mRNA设计的锤头状核酶，导入恶性胶质瘤细胞，结果发现VEGF的表达下降了56％左右。VEGF mRNA的有效抑制，为核酶临床治疗肿瘤提供了实验基础。

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1700638328 （3）前药转换基因疗法　这一疗法的基本思路是：将某种前药转换酶基因导入肿瘤细胞，再给病人使用这种对细胞无毒的前药，在肿瘤细胞局部，经前药转换酶的作用，使肿瘤局部的前药转变为高浓度的有毒药物，从而达到杀灭肿瘤细胞的效果。目前研究较多的是胸腺嘧啶核苷激酶（tk）和胞嘧啶脱氨酶（CD)。前者可将无毒的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷（6-methoxypurine arabinonucleoside, araM）转变成为有毒的腺嘌呤阿拉伯糖核苷三磷酸（araATP, adenine arabinonucleoside triphosphate)，后者是将无毒的5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成为有毒的5氟尿嘧啶（5-Fu）。1995年，Wills等人用腺病毒为载体介导HSV-tk基因治疗肝癌。此外，他们设计了由CMV启动子和AFP特异识别的增强子调控的载体可在肝癌细胞中持续表达，而在AFP阴性的其他组织细胞中不表达或表达水平很低，这样就解决了治疗中的特异性问题。Rowley等用CD基因治疗结直肠癌，结果发现，导入CD基因后，靶细胞对5-FC的敏感性提高了200倍，7d内有90％的肿瘤细胞死亡，并表现出旁观者效应。这种方法的缺点是只有转导了前药转换基因的肿瘤细胞才被杀灭，对周围未转导的肿瘤细胞却没有任何影响。但要确保所有肿瘤细胞都进行了外源基因的转导，在实践中难以达到。

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1700638330 3．抗病毒基因治疗

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1700638332 自从20世纪80年代以来，基因工程技术生产的重组干扰素等在抗病毒治疗中发挥了重要作用。近年来核苷类药物也在抗病毒治疗中崭露头角。但是，尽管化学、免疫学等抗病毒治疗已经取得了一系列的进展，疗效仍然不十分满意。随着病毒分子生物学的进展，使得我们对病毒的基因背景了解越来越多，抗病毒基因治疗也在此基础上得以发展。

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1700638334 抗病毒基因治疗以基因修饰和基因灭活最为常用。目前，重组细胞因子已经广泛应用于临床上病毒性疾病的治疗。但因为其半衰期短，进入血液和组织后很快被降解或与受体结合，所以作用时间短暂，大剂量应用则可导致较严重的毒副作用。而将细胞因子基因导入体内靶细胞中持续稳定表达，则可以克服上述缺点。基因治疗时，细胞因子作为目的基因的表达产物和外源细胞因子的作用机理不一样，处于较低水平的表达就能产生较强、较持久的抗病毒效应。实验表明，重组细胞因子的抗病毒效果可以被特异性抗体所阻断，而基因治疗时其抗病毒效应不被抗体所阻断。

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1700638336 持续性病毒感染时，病毒复制和表达产物作为较强的抗原物质引起机体对感染细胞的免疫应答，导致损伤，所以有效的抗病毒治疗包括抑制病毒复制和表达。采用反义技术和核酶技术对病毒基因组进行封闭和抑制，可达到这一目的。目前常用的抗病毒基因治疗主要有以下几个方面：

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1700638338 1．基因修饰介导的免疫疗法

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1700638340 近年来，免疫治疗的研究进展很快，但是，经过几年的临床和实验研究，表明单用细胞因子并不能取得原先设想的抗病毒效果。影响细胞因子疗效的因素很多，如在体内的半衰期太短、体内蛋白酶的分解作用、重复应用诱导体内产生抗体、与靶器官以外的器官、组织、细胞上的受体结合等因素均有关系。基因治疗是克服这些缺点的有效手段之一。如将干扰素、白细胞介素等细胞因子的基因导入靶细胞内，持续表达的细胞因子可以克服上述半衰期短、蛋白酶水解、与无关受体相结合等缺点。1989年，Bednarik等人发现分泌IFNa2的细胞对人免疫缺陷病毒（HIV）复制具有抑制作用。他们将人IFNa2基因与逆转录病毒载体的DNA重组后使IFNa2在病毒的长末端重复序列（LTR）中的启动子序列控制下表达。将该重组体转染非洲绿猴肾细胞系（Vero, A3.01)，分泌IFN水平可达50～150U/ml, 可以抑制HIV的复制。但是，向细胞培养系统中加入相同活性单位的重组IFNa2则不能抑制HIV的感染，即使用抗IFNa2特异性抗体也不能完全阻断对HIV复制的抑制。这一现象的机制尚不清楚，可能的原因是外源性重组IFNa2作用于病毒的装配和成熟过程，而内源性IFNa2主要是作用于病毒的转录水平及影响mRNA的稳定性。Fischer等将可溶性CD4+（scd4）分子的编码基因导入到体外培养的T淋巴细胞中，发现scd4分子确实可以阻断HIV-1的感染。

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1700638342 还有作者针对特定目的设计特异反式激活的启动子序列，这样在病毒感染时为表达载体提供了反式激活剂，目的基因进行高水平表达，达到抗病毒基因治疗的目的；无病毒感染时，反式激活系统不启动，目的基因的表达就处于基础水平，以免细胞因子过度表达给机体带来不良影响。这样的表达方式近似于机体自然状态下的基因调控，是一种较好的设计。由于慢性肝病患者通常都有免疫功能低下或紊乱。因此许多研究都采用基因修饰介导的免疫疗法，其中包括用细胞因子基因进行基因修饰。方法是将细胞因子基因转导入细胞，使其在体内持续分泌一定量的细胞因子，直接或通过细胞因子网络刺激机体免疫系统，达到清除病毒的目的。目前，几乎所有已经克隆的细胞因子基因都已被试用于持续性病毒感染的基因治疗研究，其中大部分细胞因子的基因治疗均能不同程度地抑制病毒作用，少数（如IL-5, IL-10, M-CSF）无抑制作用。

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1700638344 2．基因修饰病毒诱导保护性抗体产生

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1700638346 由于慢性乙肝患者针对HBV呈免疫耐受状态，体内虽有大量HBsAg, 但不能产生抗HBs, 因此，诱生保护性抗体是抗HBV和保护易感者不受HBV感染的一个重要举措。Morin等利用基因治疗技术，将HBsAg基因导入仓鼠体内，结果仓鼠血清中出现抗HBs抗体。有人认为若直接将抗HBs的编码基因导入体内，目的基因的表达产物是抗HBs, 对排除HBV感染可能更为有效。Davis与Whalen在小鼠中证明用编码HBsAg及Pre S基因与真核表达载体重组后进行DNA免疫，可诱生抗HBs及CTL。他们还用2mg裸DNA给黑猩猩作肌肉注射，一次免疫即可诱生100IU/ml的抗HBs, 再次免疫后抗HBs效价可高达14000IU/ml。提示这种方法可能发展成为慢性乙肝的一种治疗方法。有学者利用质粒pJW4303构建HBAg DNA疫苗成功表达HBcAg, 小鼠经基因枪或肌肉注射接种后抗HBc液滴度升高，小鼠产生特异性细胞毒T细胞，具有对靶细胞较强的特异杀伤能力。1991年，Felgner等将编码HIVgp120抗原的基因置于巨细胞病毒（CMV）的早期启动子的控制之下，这种重组体进行肌肉注射可诱导高滴度的特异性抗体，同时也引起特异性细胞免疫，在艾滋病预防中可能有重要意义。

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1700638348 3．反义核酸的抗病毒治疗

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1700638350 自从1978年Zamecnik首次应用体外合成的寡聚脱氧核苷酸（ODN）进行抗ross肉瘤病毒（RSV）的研究并取得较好的结果以来，应用反义核酸进行抗病毒治疗的研究进展很快。在肝炎病毒方面，Blum等设计并构建了表达抗HBV DNA的反义RNA表达载体，导入转染有HBV DNA的肝癌细胞系，结果使HBsAg的表达量明显下降。Offensperger等在体外培养的鸭肝细胞和鸭体内进行研究，证明互补于前S区5’端的反义核酸在体内、外均能完全阻断DHBV的基因表达。国外这方面的类似报道已有很多，近年国内在这方面也做了许多很好的工作。姚志强等通过合成一系列互补于HBV不同基因位点的反义硫代寡核苷酸分别导入HBV转染的2.2.15细胞，发现反义核酸抑制HBV基因表达具有序列特异性、剂量相关性、时效依赖性、修饰增强性、联合协同性和对宿主细胞无害性等高效无毒特点，其中针对HBV MRNA SPⅡ增强子帽区、多聚腺苷信号区及S基因起始区的反义核酸的抑制活性最高，对HBsAg抑制率达85％～90％，对HBeAg抑制率也近50％～60％；继而用2.2.15转种裸鼠，建立荷瘤裸鼠HBV动物模型，再用上述反义核酸治疗结果证明反义核酸在动物体内同样具有较好的抗病毒效应。季伟报道分别用HBV pre S/S基因和pre C/70.6％，对HBeAg的抑制率为22.6％；pre C/C反义重组病毒对HBsAg的抑制率为23.1％对HBeAg的抑制率为59.1％同时发现两者对HBV DNA复制也有抑制作用。冯志华等用，人工合成互补于HBV-X基因的，反义硫代寡核苷酸在2.2.15中观察其抗病毒作用，结果发现该反义核酸不仅可以抑制X抗原的表达，而且可以抑制S抗原和E抗原的表达；此外，他们还发现该反义核酸能抑制2.2.15细胞的HLA-I类抗原的表达。反义核酸抗HCV的研究始于1994年。Wakita用设计了一系列针对HCV5’端非编码区及C区的反义核酸，在HCV体外翻译系统中进行研究，结果表明针对于C基因起始密码下游区域的反义核酸能有效、特异地阻断HCV的翻译，并呈剂量依赖性抑制，针对其他区域的反义核酸抑制作用较弱。国内刘勇等报道将合成的HCVC区反义寡核苷酸导入以HCV结构区基因重组的真核表达载体pCD-SRα1转染的H9细胞观察其反义抑制作用，结果发现该反义核酸具有抑制HCV结构基因表达的效果。Mautino等设计了US-SL3启动子，控制HIV env的反义RNA, 该反义RNA在T细胞中对HIV的抑制作用增加了10倍。反义核酸抑制病毒基因表达的确切机制尚不完全清楚，可能与抑制基因转录、抑制基因转录体加工、抑制蛋白质翻译、非特异性激活细胞内RNase H、使靶核酸序列降解等均有关。获得反义核酸的途径主要有体内转录、体外转录和体外化学合成3种方法，目前需要研究寻找安全、高效、价廉的获得反义核酸及可特异导入靶细胞的方法。

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1700638352 4．核酶

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1700638354 核酶是具有酶催化作用的RNA分子，1981年由Lelf和Alfman首先发现并因而获得1989年诺贝尔化学奖。核酶具有反义核酸的一些优点，其特异性是由碱基配对原则来决定的，位于酶活性中心的两侧序列决定了核酶的特异性，也是构成活性基团的必需成分。它与靶RNA链结合后能使其在特定部位断裂，核酶本身并不被消耗，又能与另一个靶RNA分子结合，因此其工作效率非常高。应用核酶进行抗病毒治疗通常是针对病毒特定的mRNA位点进行特异性切割，使其丧失活性。1996年，Sakamoto等报道应用4种针对HCV不同部位的核酶进行抗HCV研究，结果发现，该4种核酶在体外可直接降解HCV RNA, 在体内能抑制HCV基因的表达。2002年，Morrisey等针对HBV RNA设计了耐核酸酶的核酶，该核酶可清除HBV RNA所有的转录产物，还可通过清除前基因组RNA来打破HBV的生活周期。Ramezan等针对HIV-1主要包膜蛋白的高度保守区，设计了核酶Rzl-14，HIV-1的表达几乎完全被抑制。Chang等采用串联U6和tRNA的启动子控制HIV的核酶，上调核酶的表达，从而增强了对HIV的抑制作用。

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1700638356 5．RNA干扰（RNA interference, RNAi)

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1700638358 RNAi是指导入针对目标基因的特异性同源双链RNA引起目标基因的不表达或减效表达。该现象首先于1995年由康乃尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在秀丽新小杆线虫的基因研究中发现，但是该研究小组一直不能合理解释其原因。直到1998年2月，华盛顿Carnegie研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello通过大量研究证实，双链RNA的存在可以导致RNA干扰的发生。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，也越来越为人们所重视。

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1700638360 作为基因治疗的工具，RNAi既高效特异，又简便易行。RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染、肿瘤等。CDK-2是调控细胞周期的一个关键基因，用以CDK-2位靶目标的dsRNA能阻断99.7％的细胞中CDK-2的表达，而在对照中只有0.2％的细胞中CDK-2基因的表达降低。因而，以CDK-2位靶目标的dsRNA能治疗细胞异常增殖相关的疾病，如肿瘤等。

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