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4．核酶
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核酶是具有酶催化作用的RNA分子，1981年由Lelf和Alfman首先发现并因而获得1989年诺贝尔化学奖。核酶具有反义核酸的一些优点，其特异性是由碱基配对原则来决定的，位于酶活性中心的两侧序列决定了核酶的特异性，也是构成活性基团的必需成分。它与靶RNA链结合后能使其在特定部位断裂，核酶本身并不被消耗，又能与另一个靶RNA分子结合，因此其工作效率非常高。应用核酶进行抗病毒治疗通常是针对病毒特定的mRNA位点进行特异性切割，使其丧失活性。1996年，Sakamoto等报道应用4种针对HCV不同部位的核酶进行抗HCV研究，结果发现，该4种核酶在体外可直接降解HCV RNA, 在体内能抑制HCV基因的表达。2002年，Morrisey等针对HBV RNA设计了耐核酸酶的核酶，该核酶可清除HBV RNA所有的转录产物，还可通过清除前基因组RNA来打破HBV的生活周期。Ramezan等针对HIV-1主要包膜蛋白的高度保守区，设计了核酶Rzl-14，HIV-1的表达几乎完全被抑制。Chang等采用串联U6和tRNA的启动子控制HIV的核酶，上调核酶的表达，从而增强了对HIV的抑制作用。
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5．RNA干扰（RNA interference, RNAi)
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RNAi是指导入针对目标基因的特异性同源双链RNA引起目标基因的不表达或减效表达。该现象首先于1995年由康乃尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在秀丽新小杆线虫的基因研究中发现，但是该研究小组一直不能合理解释其原因。直到1998年2月，华盛顿Carnegie研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello通过大量研究证实，双链RNA的存在可以导致RNA干扰的发生。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，也越来越为人们所重视。
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作为基因治疗的工具，RNAi既高效特异，又简便易行。RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染、肿瘤等。CDK-2是调控细胞周期的一个关键基因，用以CDK-2位靶目标的dsRNA能阻断99.7％的细胞中CDK-2的表达，而在对照中只有0.2％的细胞中CDK-2基因的表达降低。因而，以CDK-2位靶目标的dsRNA能治疗细胞异常增殖相关的疾病，如肿瘤等。
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RNAi目前被认为是机体阻止病毒复制、保护细胞免受病毒入侵的一种古老防御机制。当病毒在宿主细胞内进行增值时，dsRNA病毒或者ssRNA病毒的dsRNA中间体可以被降解成siRNA, 从而产生RNAi, 生物体通过RNAi的作用能抑制病毒的增值。同RNA核酶、反义RNA等相比，RNAi具有高度特异性，一个碱基的不同就可导致作用的显著降低。同时，具有高效性，少量siRNA分子就能较彻底抑制细胞内相应基因的表达。因此，RNAi被大量应用于抗病毒的研究中去。
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Rossi等将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制；同时将siRNA的抑制效应与反义RNA, 核酶等进行了比较，发现只有siRNA组抑制了HIV rev-EGFP的表达，其抑制率达到90％，而反义RNA, 核酶组与对照组无显著差异，这一结果同样被Novina等学者所证实。同时，CD4基因编码细胞表面HIV病毒的受体，Novina用针对CD4的dsRNA能将细胞表面HIV病毒的受体表达减少75％，从而抵抗HIV病毒的感染。
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Lieberman研究小组在自身免疫性肝炎引起的肝衰竭和肝纤维化疾病的动物模型的研究中，用针对fas基因的siRNA注射小鼠，很好地预防了小鼠肝衰竭的发生。但该研究针对的是凋亡基因fas, 并非直接针对病原体肝炎病毒基因组本身，而现今一致认为针对病毒基因的siRNA是最佳的治疗策略。已有研究表明：针对HBV病毒，一些研究者构建了含有HBV全基因的载体，和针对不同乙肝病毒的基因的shRNA表达载体分别在huh和HepG2细胞株中共转染，用放免、northern blot、southern blot等方法检测显示，siRNA中介的干扰明显抑制了HBV的复制。McCaffrey等不仅在细胞水平用shRNA抑制了HBV的复制，还在有免疫能力的小鼠和免疫缺陷的小鼠中转染shRNA, 发现HBV RNAs和基因组水平均显著下降，分泌型表面抗原下降了94.2％（细胞培养液中）和84.5％（小鼠血清中），免疫组化显示乙肝核心抗原减少99％。Shlomai等以乙型肝炎（HBV）X区和核心区为靶点，构建siRNA表达质粒Psuper-x和Psuper-core, 将质粒分别导入HBV感染细胞后，发现能显著而特异性降低X蛋白和核心蛋白的表达水平。针对HCV基因靶序列的siRNA同样能有效抑制HCV RNA的复制及病毒蛋白的表达，Randal等以NS5B为靶点化学合成siRNA并转染Huh-7细胞，发现HCV RNA表达下降80倍。Kapadia等以非结构区为靶点构建了7个siRNA表达质粒，转染Huh-7后，运用实时RT-PCR分析发现NS3siRNA和NS5BsiRNA分别使同源的病毒基因表达下调21倍和23倍，从而有效抑制病毒的复制，此研究小组进一步发现这种抑制作用并不涉及IFN途径。此外，亦有其他学者对siRNA的抗HCV效应进行了研究，均取得了明显的靶基因沉默效果。新近这些结果表明，作为抗病毒的有力武器，RNAi能胜任多种病毒的基因治疗。
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microRNA的抗病毒作用：非编码的microRNA的RNA干扰作用是植物和无脊椎动物先天抗病毒免疫反应的重要组成部分。然而哺乳动物细胞内microRNA抵抗病毒感染的机制仍不清楚。Lecellier等首次证实哺乳动物细胞的miR232抑制I型泡沫病毒PFV21病毒的富集。Hariharan等研究发现5个人编码的miRNA能够靶向HIV整个基因组，包括miR229a和miR229b靶向nef基因，miR2149靶向vpr基因，miR2378靶向env基因以及miR232425p靶向vif基因。Scaria等研究发现，人细胞编码的miR2507和miR2136能够靶向禽流感病毒A/H5N1的基因，这些靶基因对于病毒致病性和嗜组织性至关重要。最近一项研究显示，干扰素可快速调节众多microRNA的表达。通过序列预测，其中8种干扰素诱导的microRNA对丙型肝炎病毒基因组RNA有效。人工合成的相应microRNA模型也显示其对丙型肝炎病毒的复制和感染有抵抗作用。然而利用反义microRNA将这些具有抗病毒作用的microRNA中和后其抵抗丙型肝炎病毒的能力却减弱。
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目前基因治疗的研究虽然有较大进展，还有许多问题尚未解决。首先，人类目前所知的与疾病有关的基因还很不充分，对许多疾病的遗传背景了解不够，故基因治疗的应用受到极大的限制；其次，目前所采用的载体系统在导入效率、靶向性、载体容量及宿主反应等方面各有优缺点，缺乏各方面都较优良的载体；第三，在导入基因表达水平的调控方面还缺乏有效手段；第四，将治疗基因和载体导入体内必须考虑其潜在的危险性如：细胞原癌基因的激活、抗癌基因的失活、细胞DNA错配修复系统被干扰、野生型病毒再感染细胞而互补激活缺陷的重组病毒载体；刺激机体对基因修饰的靶细胞进行免疫反应；治疗基因产物所产生的非期望的细胞毒性反应等安全问题还有待于进一步研究。此外，基因治疗还有许多伦理问题。虽然体细胞基因治疗已获得社会伦理的认同，但社会和医学将对这一方法进行有关安全的控制，以不伤害患者、医务人员、病人家属和公众为基本要求。
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尽管现代医学已经取得许多令人瞩目的成就，但许多疾病如肿瘤、持续性病毒感染、某些遗传性疾病等的治疗效果仍有非常不理想。各国学者都寄希望于这一技术将来能在上述“难治性疾病”的治疗方面发挥重要作用。目前，美国已经批准了数百项基因治疗项目进入临床研究，其中部分研究已取得了较好的结果，显示出令人鼓舞的前景。我国这方面研究的起步虽然较晚，但相信在广大医务工作者和分子生物学工作者的共同努力下，一定会赶超国际先进水平，为人类健康事业作出贡献。
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【思考题】
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1．试述基因诊断的优越性及其应用前景。
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2．试述RNAi在内科学研究中的应用价值。
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参考文献
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（陈智 彭国平）
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