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从19世纪40年代后期开始，颅相学作为一种社会力量开始衰落。伦敦颅相学学会于1846年解散，甚至乔治·康姆最后也不再撰写颅相学的著作了。[23] 在1848年席卷欧洲大陆的革命浪潮蔓延至法国后，许多法国颅相学家倡导的针对个人并且谨小慎微的改革就显得非常不够了。和与自我完善对应的颅骨隆起相比，马克思和恩格斯宣扬的共产主义为个人和社会的不幸提供了更为根本的解决方案。
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对于学术界来说，颅相学的失败是由于科学思想的最终裁决者——证据。无论一个理论有多么美，多么合乎逻辑，多么诱人或者时髦，如果没有实验结果的支持，它最终都会被抛弃。就颅相学而言，法国医生马里-让-皮埃尔·弗卢朗（Marie-Jean-Pierre Flourens）开展了一系列研究，研究结果对颅相学的理论提出了尖锐的挑战。弗卢朗生于1794年，非常年轻就已经在法国学术界崭露头角。作为伟大的博物学家乔治·居维叶的门生，他不仅是法国科学院院士，而且还是极负盛名的文学机构——法兰西学术院的院士，这与加尔未能被他的第二祖国承认形成了最鲜明的对比。
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弗卢朗用各种动物开展了一系列研究，他通过外科手术移除脑的不同部分，并观察动物随后的行为。加尔曾批评过这种方法，声称不可能精确地切除脑的某个特定部分，因此也就无法保证只有那个部分受到了影响。弗卢朗意识到了这种可能，但正如历史学家罗伯特·扬所说，他的方法基本上是“我移除了这一部分后，动物停止了这种行为，所以这个部分一定是这种官能的所在位置”。[24]
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在20年的时间里，弗卢朗一直在研究各种各样的鸟类、爬行动物、两栖动物以及一些哺乳动物，其研究范围之广令人震惊。他最明晰的实验发现之一与延髓（medulla oblongata）有关。所有脊椎动物都有延髓，这种结构位于脊髓的最顶端，就在脑的下方。弗卢朗发现，延髓损伤会影响呼吸和心跳，这似乎表明延髓是生命必需的生理活动的基础性中心。当弗卢朗损毁延髓上方紧邻的结构——位于脑后侧基底部的小脑时，他发现动物的动作变得不协调了。根据他的记录，一只小脑受到损毁的鸽子表现得就像一个醉汉。[25]
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损毁脑的最外层——脑叶（cerebral lobe）则产生了非常不同的结果。如果脑叶被移除，动物就变得完全无法响应刺激——一只青蛙可以以这种状态存活长达四个月的时间，但它“处在完全糊涂的状态……它既听不到也看不到，更无法表现出拥有意志或智能的任何迹象”。弗卢朗的结论是，移除脑叶会导致“所有感知能力和一般智能的丧失，还会导致决定各个物种独特行为的所有独特形式的智能的丧失”，这些物种也包括人。
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弗卢朗拒绝接受存在大量心理官能的观点，他认为智能和意志的各个方面是合而为一的，并拒绝承认大脑皮层中存在任何解剖学上的细分结构。他认为，他发现的“最重要的结果之一”是，作为“智能中枢”的大脑皮层是一个单一的结构：
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不仅所有的感知、意志和智能官能都只存在于这个器官中，而且所有这些官能都占据着同一个空间。一旦某种官能由于这个实际的脑的某个部分受到损伤而消失，所有其他官能就都会消失。同样，一旦某种官能因为受到损伤的部分被治愈而重新出现，所有其他官能也都会重新出现。
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1842年，弗卢朗写了一部作品，严厉地驳斥了颅相学尤其是加尔的理论，此时距离加尔去世已经有14年了。通过这部厚达一本书的作品，弗卢朗证明了自己在法国学术界的核心地位。他不仅用实验发现来驳斥加尔，还援引了心智领域的法国哲学家典范——笛卡儿的著述，并把这部著作题献给笛卡儿。弗卢朗的实验表明心智是一个整体，这与笛卡儿从哲学角度出发得出的论证结果一致。他还指出，无论是在动物身上还是在人身上，许多与心智和感知有关的高级行为功能似乎都不像加尔所说的那样是高度定位化的，而是广泛分布在大脑皮层中的。弗卢朗认为，功能定位只适用于基本的生理功能以及与运动协调有关的功能。例如，中风的证据表明，如果右脑受损，那么病人就会出现身体左侧的一部分或者整个左侧瘫痪。但与人类心智的深层奥秘相比，这种功能定位对对侧运动的影响是微不足道的。心智似乎分布在整个大脑皮层中。
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加尔声称，脑的每个部分都负责产生一种特定的心智活动，这种活动在法语中被称为“专有活动”。[26] 而弗卢朗认为，脑的大部分活动似乎是全脑范围的协调活动（所谓的“共同活动”），这体现在“每个部分都会对整体产生影响，整体也会对每个部分产生影响”。弗卢朗指出，即使脑包含了一些具有特定生理功能的区域，但作为一个整体，脑“完全是一个合而为一的系统”。[27]
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弗卢朗无意中开启了一场深刻而旷日持久的辩论，辩论的一方认为脑作为一个整体运转，而另一方则认为脑包含不同的区域，这些区域分别产生不同的精神活动。在弗卢朗看来，只有最简单、最生理性的行为以及与运动相关的行为才表现出定位性，而所有代表更高层次心智活动的官能则是一个整体，以某种方式通过整个脑表现出来。
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弗卢朗的这种观点遭受的第一轮打击来自对语言的研究。加尔的颅相学观点源自他年轻时的一种信念：眼睛鼓出来的孩子最擅长死记硬背式的学习。因此，他把语言官能以及其他与记忆有关的官能定位在脑的前方，紧贴在眼睛的后部。1825年，一位名叫让-巴普蒂斯特·布约（Jean-Baptiste Bouillaud）的年轻法国医生在巴黎的法国皇家医学院宣读了一篇论文，抨击了弗卢朗关于脑不存在功能分区的观点。布约指出，许多病理学的病例表明，脑中有一个负责语言输出的功能单位，语言输出也不同于对语言的理解以及对语言的记忆。作为颅相学的公开倡导者，他还说，几十个病例表明加尔是正确的，负责语言输出的功能单位位于脑的最前端。布约声称，对于那些生前无法讲话但能理解和记住词语的病人，尸检研究都发现他们存在大脑额叶的损伤。[28]
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由于布约的观点与加尔越来越不受欢迎的颅相学之间存在联系，再加上弗卢朗充分的实验证据，这使布约的观点最初鲜有支持者。此外，还有许多明确的反例。1840年，法国病理学家加布里埃尔·安德拉尔描述了14例丧失讲话能力的病人。这些病人的尸检结果显示，他们的额叶并没有损伤。另一方面，许多额叶受损的病人仍然可以正常讲话。安德拉尔总结说，认为脑的特定部分参与了语言输出“还为时过早”。[29] 但这些发现对布约几乎没有产生任何影响，他对自己的观点非常有信心，甚至悬赏500法郎，寻找额叶受损但没有语言障碍的病人（他最终在1865年支付了赏金）。[30]
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1861年2月，巴黎的法国人类学学会主办了一系列关于脑的大小与心智能力的辩论。法国外科医生保罗·布罗卡（Paul Broca）认为，脑的大小与智力之间存在明显的联系，他还指出脑在男性和女性之间以及不同的种族之间可能存在差异。[31] 布罗卡的观点是对美国医生塞缪尔·莫顿1839年提出的观点的拓展。使用不同种族的颅骨测量数据，莫顿确定了这些颅骨的容量，并将其与所谓的智力差异关联了起来。莫顿毫不意外地发现，他所谓的“白种人”在智力上优于其他“种族”，这反映在他们的颅骨大小上。[32]
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在这些辩论中，与布罗卡针锋相对的是法国动物学家路易-皮埃尔·格拉蒂奥雷。格拉蒂奥雷曾采用比较解剖学的方法把大脑分成四个叶，并根据覆盖它们的颅骨依次将其称为“额叶”、“顶叶”、“颞叶”和“枕叶”，这种命名法一直沿用至今。此外，他还证明了大脑的沟回在同一个物种的不同个体间是一致的。[33] 格拉蒂奥雷认为，心智和脑都是不可分割的，不存在功能的分区，颅腔容量和智力之间也没有简单的联系。
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针对格拉蒂奥雷的观点，布约的女婿、内科医生欧内斯特·奥比坦提供了一些令人震惊的证据，以一个试图用手枪自杀的巴黎病人为例，证明了脑功能定位的存在。枪伤使这个可怜的病人的前额叶被直接暴露了出来。在治疗这个病人的过程中（最终还是失败了），奥比坦做了一个可怖的实验，很容易让人联想到1700年前盖伦用猪做的研究：
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在病人说话的时候，我把一个大的压舌片的平端放在他的脑的前叶上轻轻按压。病人的讲话立刻就停止了，已经开始讲出的词也没有讲完。按压一结束，讲话就恢复了。在这个病人的脑叶上非常小心地进行按压，对脑的一般功能没有影响，语言能力是唯一受损的官能，并且只有在按压前叶时语言能力才会暂时丧失。[34]
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这有力地说明布约是正确的，而脑的前部确实是说话所必需的。
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不到两个月后，一个偶然的事件为布罗卡提供了测试这个想法的机会。1861年4月，在法国人类学学会的一次会议上，布罗卡向他的同行们展示了一个刚过世不久的51岁老人的脑。这个人生前已经有21年无法说话了，他唯一能重复发出的声音就是“坦、坦”。因此，在他作为住院病人居住了20多年的医院里，人们称他为“坦”。“坦”的真名是路易·勒博涅，他一生都患有癫痫，却能从事鞋楦匠人的日常工作。30岁时，他突然失去了说话的能力。[35] 虽然他在入院时被诊断为身体和智力都正常，但他的身体右侧逐渐瘫痪，视力也不断减退。1861年4月12日，勒博涅因严重的坏疽被收入布罗卡的外科病房，这是布罗卡第一次见到他。虽然勒博涅不会说话也不会写字，但他能看懂时间，还能通过打响指来表达数字。布罗卡的印象是，虽然勒博涅无法通过语言表达自己的想法，但他比看起来更聪明。五天后，可怜的勒博涅去世了。尸检结果显示他的大脑出现了一系列的病变，主要集中在左侧额叶。布罗卡总结说：“发现的一切都让我相信，在这个病例中，大脑额叶的损伤是语言输出能力丧失的原因。”[36]
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布罗卡很快发表了一篇论文，详细地陈述了他的观点。在这篇论文中，他把勒博涅的情况与布约关于语言输出功能定位于额叶的观点联系了起来。[37] 他还对勒博涅的脑进行了详细的解剖学描述，将功能的逐渐丧失与病变的扩散进行了一一对比，从而进一步说明了一些官能是定位在脑中特定的区域的。虽然布罗卡坚持说他无意使加尔的颅相学在科学上受到重视，但他使用的术语完全是颅相学的：他声称正在探索口语的官能及其在脑中对应的潜在功能单位。
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几个月后，又有一名病人转诊到布罗卡处。这位髋部骨折的病人名叫勒隆先生，他在5个月前失去了说话的能力，只能说出几个字，其中包括“勒洛”——这是他在努力读出自己的姓氏。入院近两周后，勒隆去世。尸检结果显示，他的左额叶有一处病灶，与在勒博涅脑中观察到的病灶所在的区域完全相同。[38] 布罗卡在报告中说，当他发现这一点时，他感觉自己“震惊到接近心神恍惚的地步”。然而，他还是更愿意把自己的工作放在布约理论的背景之下，认为整个额叶都参与语言的输出功能。布罗卡声称，这两名患者大脑的左侧均表现出相同的、局域化的病变，这纯粹是一种巧合。[39]
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在收集了8例语言输出能力缺失或失语症病例后，布罗卡小心翼翼的态度开始消退，因为所有这些病例的状况都与左额叶同一区域的损伤有关。1863年4月，布罗卡发表了一篇论文，陈述了这些结果，但文中仍旧充满了谨慎的态度，这表明弗卢朗的反定位主义思想在当时仍占主导地位：
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这里我们有8个病例的病变位于第三额回的后三分之一处。这个数字似乎大到足以做出一些强有力的推测。颇为值得注意的是，在所有这些病人中，病灶都在左侧。我不敢从中得出任何结论，我等待着更多的发现。[40]