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于是，1865年，巴斯德放弃了对发酵的研究，在阿莱建立了一个实验室，接下来的五年中，他将在那里研究蚕的问题。经过两年的努力，他确信蚕受两种不同的传染病的影响，即微粒子病和淡色病，分别由不同的寄生微生物引起。到1868年，他已经能够指出造成这些病症的原因以及如何控制它们，从而挽救了法国的又一大产业。同时，这些研究也极大地推动了细菌病源论的发展。
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一位植物学家款待了一位不知名的医生 。巴斯德于1868年中风，他的健康状况以及普法战争及其余波一度限制了他的活动。直到1877年，他才重新开始研究动物和人类的传染病。与此同时，亨勒于1840年提出的问题终于从其他方向传来的研究成果中得到了解答。1865年，约瑟夫·李斯特首次出色地将巴斯德的研究应用于人类疾病的控制上。（稍后将对此进行详细讨论。）同年，法国陆军外科医生让-安托万·维尔曼向医学院报告了一系列实验，表明结核病可以通过接种传播，从一只受感染的动物传染给另外一只。他的工作在其1868年出版的重要著作《结核病研究》中得到了进一步的发展。维尔曼从这些越发深入的研究中得出结论，结核病不会因为空气条件的改变、遗传因素或恶劣的环境而自发地在人或动物体内生长，而是由某种系统的毒性原理所引起，可能是一种微观的细菌，它能够在受影响的机体内繁殖，并通过直接接触或空气传播。然而，他没能证明这种细菌的存在，他的工作也没有产生应有的影响。也正是在这一时期，卡西米尔·达韦纳展开了对炭疽病的研究，引起了科学界和医学界的兴趣，并帮助巩固了疾病的病菌理论。
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到了19世纪70年代，巴斯德等人所做的调查使得微生物与疾病之间的关联问题得到了部分解决，但还没有找到最终的确凿证据。不过，这必须要等到有了能够严格控制实验的技术，特别是分离和处理微生物的技术才行。由于人们对微生物的生物学认识还很混乱，所以对微生物和疾病的思考也是如此。许多研究者都声称观察到甚至证明了一种生物可以转化为另一种生物。奥地利著名的外科医生西奥多·比罗斯则坚信，只有一种生物能够进行无限的变异。显然，这样的想法很难产生清晰的认识。与这种多形性理论相对立的是另一种观点，认为存在特定的生物，它们形态恒定，可加以辨识，这种观点主要是由于巴斯德在发酵上做出的努力。巴斯德试图获得这种纯态的生物，但由于他所使用的方法，尤其是液体培养法，他的成功没能更上一层楼。其他研究者也曾试图用液体培养基获得纯培养物，但困难重重。
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19世纪70年代开启了一个以技术和知识的坚实进步为特点的时期。这在很大程度上要归功于费迪南德·科恩（1828—1898），他是当时最重要的细菌研究者，为细菌学的建立做出了巨大贡献。科恩对细菌的研究是从认识到细菌的植物性开始的。1849年，约瑟夫·莱迪将细菌列为植物界的一员，但坚定地把细菌确立为植物的是科恩。从1851年开始，他进行了二十多年的系统研究，主要是为了让人们能够对细菌及其在自然界中的位置有较清晰的认识。科恩发现，有必要根据细菌的属和种进行精确分类，但他也清楚地看到，仅靠形态学是不够的。他充分了解到，形态上相似的生物在生理特征上可能有很大的差异，而生理特征可以作为分类的标准。在这方面的极其重要的进展是由科恩的学生兼同事约瑟夫·施罗特（1835—1894）在关于产色细菌的色素生产的研究中所实现的。他在固体培养基（如马铃薯、面团、肉或蛋清白）中培养有机物，并发现了特殊的有色菌落。不同的菌落的细菌存在差异，但同一个菌落中的细菌是恒定的。毫无疑问，施罗特获得了他所研究对象的纯培养物，或者从本质上说，他已经开发出了一种获得纯培养物的技术。然而，这项技术的深远应用有待其他人的开发。
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1876年4月底，科恩在他的实验室里接待了一位不知名的乡村医生，他声称发现了导致炭疽的芽孢杆菌的生命史。达韦纳的实验表明，炭疽热极有可能是由血液中的杆状生物引起的，他称之为拟杆菌。虽然这一观点得到了其他研究者的认同，但该病的自然史仍留有空白。这时，乡村医生罗伯特·科赫（1843—1910）为炭疽的谜团带来的一片光明，揭开了它的神秘面纱。科赫住在沃尔斯坦，这是波森的一个小镇，靠近布雷斯劳，他在那里行医并担任地区医务官。出于想要用实验研究疾病的愿望，他在家中建立了一个实验室，并在看诊间隙抽出时间研究炭疽热。他用老鼠作为实验动物，用病牛的血液给它们接种，很快就发现了达韦纳所描述的杆菌。科赫证明，这种疾病可以在一系列老鼠身上传播和繁殖超过二十代。接着，他又继续研究杆菌的生命周期，并为此设计了一种悬滴标本，可以让有机体在其中生长和接受观察。在研究过程中，科赫发现了炭疽杆菌的芽孢期，从而证实了科恩关于该菌生命周期中存在耐药阶段的预测，并证明了孢子会再次发育成典型的杆菌。这些现象的流行病学意义并没有被他忽视。最后，科赫表示，分离出的炭疽杆菌和其他微生物都不会在易感动物身上发作。他清晰无碍地向人们证明，其在哥廷根的老师——亨勒——所假定的条件是正确的，医学细菌学即将诞生。
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由于费迪南德·科恩被认为是当时最重要的细菌研究者之一，科赫自然而然地找到了这位在布雷斯劳附近生活的著名教授，向其展示自己的研究成果。1876年4月30日，一场具有历史意义的演示在科恩的研究所启动，持续了整整三天。在场的有病理学家朱利叶斯·科恩海姆和卡尔·维格特、解剖学家L.奥尔巴赫以及化学家莫里茨·特劳伯。科赫以自己的发现彻底征服了他们，他的经典论文在科恩的支持下于1876年发表，立即就被视为一项重大贡献。疾病的微生物起源第一次无可争议地得到了证明，其自然史也得以阐明。
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到19世纪70年代中期，进一步研究细菌及其导致的疾病所需的由知识和技术构成的决定性基础已奠定了。在接下来的二十年里，发展几乎呈迅猛之势大步向前，但大致而言遵循的是两条不同的路线。一条路线以科赫的研究为代表，发展了培养和研究细菌的技术方法。而巴斯德和他的同事们则选择了另一条路线，他们将注意力转向感染机制，并将这种知识用于传染病的预防和治疗。
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科赫致力于研发细菌处理技术，以获得纯培养物。他的研究中最重要的是使用固体营养培养基来培养生物，并采用固定和染色的方法。起初，他尝试使用明胶，但不久后，在一名同事的妻子海斯夫人的建议下，他用琼脂取代了明胶。这种物质相对明胶更有优势，最终成为全球细菌培养技术的标准培养基。染料在细菌研究中的应用是从组织学的染色方法发展而来。1869年，吉森大学植物学教授赫尔曼·霍夫曼曾尝试在水溶液中用洋红和品红对细菌进行染色。然而，作为一种实用技术的细菌染色始自1875年卡尔·维格特（1845—1904）的实验，他发现可以通过甲基紫染色来显示组织中的球菌。从1877年起，科赫一直在大力改善染色法，在接下来的几十年里，该领域进展迅猛。这很大程度上要归功于保罗·埃利希（1854—1915），他用苯胺染料成功染色了白细胞。
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有了科赫发明的方法，多少能够系统地解决各种传染病问题才成为可能。在数年里，主要是1877年到1897年间，微生物作为许多人类和动物疾病的病因首次被揭示出来，德国的研究者们获得了巨大的成功。在19世纪80年代以前，微生物只被证明是少数疾病可能或确定的病因。奥博梅尔（1868—1873）就发现了在回归热的病例中始终存在一种螺旋体生物，并且证明了这种疾病的传染性；科赫在1876年证明了炭疽杆菌的致病作用；奈瑟在1879年发现了淋球菌。然后，在19世纪80年代，迎来了细菌学发现的黄金时代。现在回过头去看，显然当时的形势已成熟。犹如大坝决堤一般势不可当，各种疾病的病原体被接连证明，常常一年内就有好几种。从表3中可以清楚地看到这一进程发展迅速的特点。
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随着研究者们不断揭示这些生物的存在以及对它们致病作用的确认，人们对微生物作用机制产生了疑惑。细菌感染是如何产生的？要如何预防这种感染或治疗它所引发的疾病？1877年以后，法国细菌学界在巴斯德及其同事的领导下，开始着手解决这些问题。由于认识到感染的抗药性的重要性，巴斯德将注意力集中到与之相关的实践和理论中。炭疽热室内实验的一些迹象表明，感染的易感性是可以改变的。例如，巴斯德发现，如果降低母鸡的体温，它们对炭疽的抵抗力也会随之降低。他还观察到，致病微生物的毒性可以在不同的条件下被改变。因此，1880年至1888年间，巴斯德开始研究如何改变致病细菌的毒性。根据詹纳疫苗接种提供的线索，他设想通过这种减毒株制备的疫苗来预防传染病。巴斯德最重要的成就是他在鸡霍乱、猪丹毒和狂犬病方面所做的研究，这些研究推动了免疫学的发展，并对20世纪初建立一个科学的公共卫生计划产生了深远而又实际的影响。
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表3 病原体的发现
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外科手术中的消毒和无菌操作 。当巴斯德、科恩、科赫及其他研究人员通过证明致病微生物，为传染病的研究打下坚实基础的同时，在英吉利海峡的另一边，一位年轻的外科医生为细菌病源论提供了进一步的支持，他将该理论应用于预防伤口感染。直到19世纪中叶，外科手术一直在两个方面备受限制。其中最重要的一个方面是几乎无法避免的伤口感染，这种感染常常以致命的败血症收场。此并发症在医院里特别常见，病人们神秘地死于“医院气疽”，或死于更含糊其词的“医院病”。另一方面的限制来自止痛手段的不足。它缩小了手术干预的范围，因为手术速度对减少病人的休克至关重要。1846年乙醚麻醉的引入使手术无痛化，但可怕的败血症仍贻害无穷。如果说有什么变化发生，那就是所谓的医院病越来越猖獗，在许多地方大肆流行。以至于，纽伦堡当局甚至考虑拆除综合医院，英国林肯郡医院的院长和工作人员也接受了类似的极端做法。詹姆斯·辛普森爵士对当时的情况做了这样的总结：“在我们的一家外科医院里，躺在手术台上的人比滑铁卢战场上的英国士兵面临着更多的死亡威胁。”外科医生约瑟夫·李斯特（1827—1912）就是在这种背景下，开始推行杀菌防腐手术。
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在职业生涯的早期，李斯特就开始研究炎症，他怀疑伤口的感染和化脓是由于组织的腐烂。此外，他觉得这个过程是由空气中携带的某种物质造成的，单纯性骨折病人和复合性骨折病人死亡率的显著差异更加坚定了他的信念。这两种情况的主要区别是，后者的皮肤被撕裂了，皮下组织接触到了空气。1865年，李斯特的同事、爱丁堡的化学教授托马斯·安德森提请他关注巴斯德的研究，当时巴斯德刚刚证明了细菌在空气中无处不在，发酵（腐烂是其中的一个变种）是因为受到这些微生物的污染。李斯特立即意识到，巴斯德的发现和伤口感染问题之间可能存在联系。这里无疑是“有准备的头脑”在起作用的一个典范。此外，李斯特认为，“通过使用一些能够破坏悬浮颗粒的生命的材料作为敷料，可以在不隔绝空气的情况下避免受伤部位的腐烂”，这是一个合乎逻辑的发现。李斯特想到有一种化学物质似乎最为合适，那就是卡莱尔用于污水消毒的石碳酸。（尽管他并不知道，法国医药化学家朱尔斯·勒麦尔早在1860年就建议使用石碳酸作为消毒剂。）李斯特所称的“杀菌原理”于1865年8月12日得到首次应用，他的研究报告则发表在1867年3月至7月的《柳叶刀》上。
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这种消毒处理伤口的方法产生了惊人的效果，但一开始李斯特的事业发展得并不顺利。虽然他最早发表的文章在某些领域受到了热烈欢迎，但文章中提到的技术和原理既没有迅速被人们所接受，也没有得到广泛的传播。大多数时候，他的同事们的回应是轻蔑，是尖锐的批评，是公开的谴责。在这方面，李斯特的经历与他的前辈霍姆斯和塞麦尔维斯在解决伤口感染之谜时的经历没有什么不同。奥利弗·温德尔·霍姆斯（1809—1865）于1847年独立发现了引发产褥热的线索。正如塞麦尔维斯说的那样：“产褥热是因为检查时医生的手指将生物的腐败微粒带入孕妇体内而造成的。”他们两位都遭到了反对、谩骂，塞麦尔维斯甚至还遭到了恶意的迫害。结果，霍姆斯不得不回归教授身份，在文学的怀抱中寻求慰藉；而塞麦尔维斯则在经历多年不公后，被逼疯送进了疯人院，几天后，他就因手指受伤化脓而去世了，讽刺的是，他正是被自己所极力想要预防的疾病所害。
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不过，李斯特在克服外界阻力方面处于更有利的位置。事实上，他可能会以十年后霍姆斯所做的描述来形容眼下的情况。霍姆斯说：“一小支微生物军队向我挺进，来支持我的立场。”当时，细菌学正在研究这个问题。达韦纳的兔子败血病实验（1872）、克雷白对枪伤病理的研究（1871、1872），以及最后科赫（1878）和奥斯通（1880—1883）关于创伤传染性疾病病因的决定性研究都无可争辩地证明，创面脓血症是由特定的致病细菌引起的。
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此外，李斯特很快在欧洲大陆收获了一批追随者。其中大部分是德国人（蒂尔施、冯·沃克曼、特施罗迈尔、萨克斯托夫、冯·贝格曼），但也有一些法国外科医生（卢卡斯·尚皮奥涅最为活跃）。通过他们的影响以及李斯特本人的努力，杀菌原理最终也被英国接纳了。但李斯特的方法一直比较粗糙，在19世纪80年代，他的方法逐渐被以无菌原则为基础开发出的技术所取代。这些技术主要是由柏林的冯·贝格曼发明，通过加热、化学和物理手段，尽可能地消毒任何进入手术区域的东西——手、器械、亚麻布，以确保操作现场不受细菌的感染。基本上，这些方法是从细菌处理技术中的灭菌衍生出来的。这些方法（特别是从细菌学研究中发展而来的方法）在公共卫生实践中也有重要的应用，尤其是在传染病的检测和控制方面。
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细菌学和公共卫生 。到19世纪的最后十年，通过大量实例来证明病原体的存在以及向公众展示预防感染的方法，与传染病相关的一些问题得到了解答。不过，部分实验结果仍然是未解之谜。对一些疾病而言，如伤寒和霍乱，的确出现了未直接接触病人而受感染的新病例。然而，对另一些疾病而言，则出现了与病人接触而未被感染的情况。要充分了解微生物感染的来源和模式，很显然，必须补充更多的知识。在19世纪最后十年和20世纪头十年里，大量出色的研究揭示了病媒或中间宿主在传染病传播中起到的作用，细菌病源论中那些晦涩难解的问题终于有了答案。
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人们发现，看上去健康的人也有可能是病原微生物携带者。早在1855年，佩滕科弗就提出无症状的病原携带者会传播霍乱，但这一假设直到19世纪末才得到证实。弗里德里希·洛弗勒（1884）、埃米尔·鲁和亚历山大·耶尔森（1889）在健康人的咽喉中发现了毒性白喉杆菌，他们还发现康复期的病人身上仍然存在着感染性微生物。不过，这些都是孤立的观察，还不能就此得出结论。直到1892年和1893年的霍乱大流行，人们才第一次意识到病原携带者的重要性。1893年，科赫虽然强调了康复期带菌者在研究中的重要意义，但当他了解到无症状病原携带者的作用后，他却不认为这件事有多重要。然而，在同一年，威廉·哈洛克·帕克（1863—1939）和他的助手阿尔弗雷德·L.毕比在纽约市卫生局细菌学实验室进行了一系列研究，在研究过程中他们确立了白喉带菌者的概念，并证明了常规细菌学检查在疾病诊断中的价值。帕克和毕比共检查了48组无症状的家庭接触者，并在24组中发现了白喉杆菌。他们得出结论，“出现白喉病例的家庭应被视为危险的源头，除非从他们的喉部采集的培养细胞显示没有白喉杆菌”。最后一个重要的知识点有助于理解传染病在社区内的传播过程。伤寒是第三种能证明带菌者重要性的疾病。这一点首先由里德、沃恩和莎士比亚指出，他们在1900年对美西战争期间军营中流行的伤寒病展开了研究，两年后罗伯特·科赫也提出了相同的观点，后者的影响力使人们开始接受这一概念。在20世纪头十年，以流行性脑脊髓膜炎和小儿麻痹症为例，带菌者的重要性也得到了证明，到1910年，C.V.查宾出版了他的经典著作《感染的来源和模式》，病原携带者的作用完全明确了。
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与这些贡献并驾齐驱的是同样重要的关于病媒动物作用的证明，它填补了细菌病源论最后一个重要的空白。实际上，中间宿主问题的解决方法并非横空出世，与其他科学领域一样，它也经过了一系列漫长的观察、理论和实验。早在1790年，丹麦医生兼兽医彼得·克里斯蒂安·阿比尔高（1740—1801）似乎就观察到，动物寄生虫可能在不同的动物宿主身上度过生命周期的各个阶段。然而，这种被称为“转换寄生”的现象直到19世纪后半叶才与疾病传播联系在一起。1851年，F.库克斯梅斯特通过实验在绦虫身上证明了这一现象。然而，要想取得进一步的发展，还需要更多的寄生生物学知识，这时一些动物学家提供了帮助，其中鲁道夫·刘卡特（1822—1898）表现最为突出。事实上，他对人类寄生虫的研究是这一领域所有后续研究的基础。在刘卡特的启发下，俄国自然学家费得申科于1858年发现了麦地那丝虫的生命周期，并证明这种寄生虫是由小型节肢动物水蚤传播的。接着，1868年，刘卡特和梅尔尼科夫证明了狗绦虫是通过狗虱传播的，并证明以动物为食的寄生虫可以作为中间宿主传播疾病。1877年，时任大清帝国厦门海关医官的万巴德（1844—1922）对引起丝虫病的寄生虫班氏丝虫的生命周期进行了说明。他表示，这种寄生虫的幼虫被携带着血液的蚊子吸食后，以血液为养分，在蚊子体内生长发育，于是，他得出结论，蚊子会将寄生虫传染给新的受害者，不过他推断出的传染机制最后被证明是错误的。万巴德的工作对整体上的流行病学思想没产生什么影响，但依然非常重要，因为它直接推动了罗斯有关疟疾的研究，最终使病媒动物成为全世界关注的焦点。
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尽管有了这些研究，但直到19世纪最后十年，人们才充分认识到病媒动物的真正意义。1893年，西奥博尔德·史密斯（1859—1934）和F.L.基尔伯恩关于得克萨斯牛瘟的报告终于引起了人们对这个问题的广泛关注。在一系列精彩而具说服力的实验中，他们证明了这种疾病是由一种攻击红细胞的原生动物寄生虫二联巴贝虫所导致的，它以感染的牛为食，从而将病原微生物传给了它们的后代，从第二代起，它们就能使易感牛感染牛瘟。
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动物带菌者已无法再被忽视，接下来的几年里，这种传播类型在其他重要传染病中也得到了证实。戴维·布鲁斯（1855—1931）在1894年至1895年研究出了那加那病的病因，这是一种祖鲁兰地区的牛和马感染的疾病，他指出该病是因一种由采采蝇传播的锥虫所引起。接着在1897年，印度军医所的军医罗纳德·罗斯（1857—1932）揭开了疟疾的秘密。1880年，法国军医阿方斯·拉韦朗（1845—1922）发现了疟疾寄生虫，即现在所说的疟原虫，但关于其感染方式仍然没有一丝线索。1894年，万巴德提出疟疾是由蚊子传播的理论。这个假说并不新鲜。像朗契西这样的老一辈的学者曾将蚊子与疟疾联系在一起，并且在19世纪，有一些研究疟疾之谜的学者也提出过蚊子可能传播疟疾热。1853年委内瑞拉的路易斯·博珀提（1803—1871）以及1882年美国的A.F.A.金（1841—1914）对这一观点做过最清晰的解释。拉韦朗（1884）、弗吕格（1889）和科赫（1892）也赞同疟疾寄生虫是由蚊子传播这一观点。
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罗斯对印度的疟疾产生了兴趣，1894年，在休假期间，他去伦敦找到了万巴德，从他那里了解了蚊子理论。罗斯被深深地吸引了，他决心在回到印度后对这一假说进行验证。经过两年的不懈努力，1897年8月20日（“蚊子日”），他在一只“斑翅蚊”（按蚊）的胃壁上发现了人类疟疾寄生虫。关于这一重大发现的种种影响，也许没有比罗斯本人的展望描述得更恰切的了——在他于几日后创作的那首壮丽诗篇的最后一节中，他写道：
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我发现了这个小东西
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