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中缝核区域的细胞主要产生5-HT这种神经递质。如果电损毁中缝核，脑内5-HT含量减少，此时，动物出现不眠状态，慢波睡眠明显减少。蓝斑区域的细胞主要产生NE。如同5-HT在慢波睡眠中起明显作用一样，NE在导致快波睡眠中起一种重要作用。如果损毁蓝斑核，使脑内NE含量明显下降，快波睡眠就要受到抑制或完全不产生。
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高效液相色谱（HPLC）是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别对不同溶质进行分离。对5-HT和NE等神经递质的测定方法甚多，唯独高效液相色谱法快速、简便、灵敏，应用广泛，并可对多种化合物同时进行分离测定，是目前比较理想的方法。
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【实验对象】
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SD品系大鼠2只，1只剥夺睡眠，1只正常对照。
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【实验用品】
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（1）仪器：高效液相色谱仪（美国Waters公司生产，高压泵为Waters 590型，电检测器为Waters460型，积分仪为HP3394型，色谱柱为1L荣酚胺专用分析柱），高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂生产），超声波粉碎机。
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（2）主要试剂：5-HT与NE标准品（美国Sigma公司生产），B-8离子对试剂（天津化学试剂工厂），二正丁胺（北京朝阳西会化工厂，进口分装），无水乙酸钠（AR，北京化工厂），柠檬酸（GR，北京化工厂），0.1mol/L过氯酸内含0.3mmol/L Na2EDTA与0.5mmol/L Na2 SO3（GR，北京化工厂），100%甲醇（GR，北京化工厂），3,4-2羟基苄胺（3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA，美国Sigma公司），乙二胺四乙酸二钠（EDTA，GR，北京化工厂）。
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（3）标准样品：由教师预先配制好，每微升（μL）中含NE，5-HT和DHBA各25×10-12g。
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（4）50mmol/L乙酸钠-柠檬酸缓冲液（流动相）：教师预先配制。无水乙酸钠4.10g，柠檬酸9.50g，EDTA（乙二胺四乙酸二钠）111.6g,100%甲醇20.0mL，B-8离子对试剂4.0mL，加蒸馏水定容至1000mL。
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（5）建立睡眠剥夺动物模型：将大白鼠放入条件反射箱内，箱底的铜栅可通电，由电子刺激器自动每隔5min通电一次，电压50V，电流1mA，24小时剥夺睡眠。
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【实验内容】
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1．制备组织样品
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将剥夺24小时睡眠的大鼠断头取脑，在冰水中迅速分离出皮质、中脑、脑桥和延髓4个脑区（图6-3）。称取10～30 mg脑组织，置于300μL预先冷却的0.1 mol/L过氯酸中，根据脑组织多少加入1～2滴内标物DHBA，超声波粉碎机匀浆，然后高速离心（15000 r/min）15分钟。
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图6-3 大鼠脑分区示意图
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2．进样分析
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取离心后上清液10μL进样，打开仪器。调整色谱条件为：流动相为50mmol/L乙酸钠柠檬酸缓冲液（pH3.5），流速1.0mL/min，玻璃工作电极，Ag/AgCl参比电极，检测池电压为＋0.75V，DHBA为内标物，样品中每个组分用内标分析法进行定置，结果由HP3394积分仪计算并直接打印。
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3．对照组
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将正常饲养的对照组大鼠按照上述程序测定5-HT与NE。
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4．结果
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剥夺睡眠大鼠的中脑和脑桥两部分脑组织的5-HT含量比正常大鼠要高，NE要低。有研究表明，中脑和脑桥部分的网状结构对控制和维持觉醒状态是极其重要的。中缝核的前核细胞产生5-HT抑制黑质和蓝斑产生多巴胺和NE，引起慢波睡眠。如果剥夺睡眠，就会使中缝核分泌的5-HT积累起来，而NE因受抑制而含量减少。
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【说明及建议】
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（1）正式测定前需让高效液相色谱仪运转较长时间，这样仪器比较稳定，测出的结果比较好。
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（2）积分仪需根据实际情况调整灵敏度、增益等参数，以达到最佳的记录效果。
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