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现代生理心理学实验教程 实验27 心理性应激对大鼠神经内分泌和免疫功能的影响
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【实验目的】
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通过实验学习和掌握纯心理性应激动物模型的建立方法，以及应激对大鼠神经内分泌和免疫力功能的影响及其有关的测试方法，并在此基础上进一步了解神经系统、内分泌系统和免疫系统三者之间相互关系。
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【理论基础】
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应激是机体受到外界刺激时，内稳态受到威胁，产生的旨在重新建立内环境平衡的一系列复杂的生理行为反应。应激有躯体性应激和心理性应激。关于各类应激造成免疫功能下降已有大量报道。有研究表明，心理性应激与许多人类疾病的发生和发展关系密切，如亲人去世、离婚和失业等生活变故等，这些心理应激事件大多伴随着强烈的情绪反应，可以导致机体免疫功能下降。研究发现，情绪应激导致包括淋巴细胞增殖反应降低、细胞毒性下降、淋巴细胞亚类的数量百分比发生改变、抗体反应降低等免疫功能变化。但应激对免疫功能的影响是十分复杂的，特别是它的作用机制目前还没有搞清楚。本实验以情绪应激作为应激源，看看在它的作用下，大鼠的细胞免疫和体液免疫有何变化，以及糖皮质激素是否参与免疫系统功能的调节。
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建立情绪应激动物模型，采用透明有机玻璃板把条件反射箱隔成大小相等两小间，其中一间底部有电栅，另一间没有。实验时把一只小鼠放入有电栅的一间，对其进行足底电击，电压30V，电流强度小于1mA，每次电击5s，休息10s，共电击60次。与此同时，另外一间不通电的小间中放入另一只小鼠作为情绪应激鼠。电击时被电击鼠的反应如：跑动、跳跃、嘶叫等对情绪应激鼠的听觉、视觉、嗅觉以强烈的刺激，作为应激源使之生产恐惧、紧张、焦虑等情绪。
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本实验是演示实验，由老师讲解整个操作过程，分为下面三个子实验进行。
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【实验内容】
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（一）3H掺入法测定脾淋巴细胞的转化
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1．原理
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T淋巴细胞在体外培养过程中受到有丝分裂原和特异性抗原刺激时，可发生母细胞转化。刀豆蛋白A（Con A）使T淋巴细胞母细胞转化的机理可能是它与细胞膜上的受体结合，使腺苷酸环化酶活化后导致cAMP增多之故。由某种抗原致敏的T淋巴细胞，在体外如果再次遇到相同抗原时，发生母细胞转化，称为特异性转化。
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2．仪器和试剂
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常用手术器械一套，注射器，不锈钢网（200目），血球计数板，96孔培养板，微量移液器，吸管多支，玻璃纤维滤纸；离心机，β计数器（含闪烁液），CO2孵育箱，多头细胞收集器，烤箱。
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刀豆蛋白A（Con A，中国科学院上海生化研究所产）。LPS（美国Sigma公司生产），生理盐水，蒸馏水，1.8%NaC1溶液，2%乙酸。
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RPMI 1640培养液：称取RPMI1640粉10.4 g（美国Sigma公司生产），加重蒸馏水约500mL，混后加1mol/L HC1 2mL，待完全溶解后加入1mol/L NaOH 2 mL调pH至7.4～7.6，补加蒸馏水至1000mL。用6号玻璃器除菌分装，—20℃保存备用。
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完全培养液：临用前每80mL RPMI 1640培养液加20mL10%小牛血清（fetal bovine serum,FBS），再添加30g/L谷氨酰胺1mL，灭菌的60g/LNaHCO33mL，10000u/mL链霉素和10000u/mL青霉素各1mL。
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3．方法
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（1）将已经建立情绪应激模型的动物在最后一次电击实验后立即麻醉断头处死，开腹取全脾，将之剪成约5mm长的小段。
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（2）将脾放在不锈钢网上，分次加入4～6mL生理盐水，用一注射器芯挤压过滤网（注意：不得采用碾磨的动作），得单细胞悬液。
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（3）将2～3mL上述悬液倒入离心管，1000r/min离心5min，弃去上层清液。
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（4）在上述沉淀中加入3～4mL无菌蒸馏水或去离子水，振荡10～15s后，迅速加入等量的1.8%NaC1溶液，将液体调回等渗（此步骤的目的是破坏红细胞）。
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（5）1～2min后，待被破坏的红细胞残渣沉底后，将上层悬液移入另一离心管，1000r/min离心5min，倒去上层清液。
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（6）在上述沉淀中加入3mL完全培养液，振荡后得纯白细胞悬液。
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（7）将上述悬液吸出100μL，用2%乙酸稀释50～100倍后，显微镜下用血球计数板计算每毫升悬液中所含的白细胞数。
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（8）用完全培养液将白细胞悬液的浓度调至5.0×106个/mL备用。
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