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内科学新进展 [:1700627029]
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内科学新进展 第三节 病毒性肝炎病原学研究现状
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摘 要 引起病毒性肝炎的病原体主要有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒病毒。此外近年来又发现一些可引起肝脏炎症的病毒，HGV/GBV-C、TTV、TLMV和SEN病毒等。对于肝炎病毒病原学的研究近年来主要集中于对它们的基因结构的深入解析，即基因结构与功能的分析。研究的侧重点已从纯病毒颗粒本身的研究延伸至病毒种群、基因型别、基因准种在感染者体内的动态变化及其意义。研究手段已不仅仅以经典的生物遗传学（正向遗传学 forward genetics），而是结合反向遗传学（reverse genetics）的研究思路，应用如基因突变、敲除（knockout）或敲倒（knockdown）等技术，以期发现新的嗜肝性肝炎病毒病原体与揭示肝炎病毒的基因结构与其功能。
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Abstract Viral hepatitis is caused by five reasonably well-characterized hepatitis viruses, hepatitis A, B, C, D and E virus. Hepatitis A virus is a picornavirus, a small single strand RNA virus; hepatitis B virus belongs to the hepadnavirus family of double stranded DNA viruses; hepatitis C virus is a flavivirus, a single stand RNA virus; hepatitis E, also an RNA virus, is similar to a calicivirus. Hepatitis D which is also known as Delta agent is a circular RNA that is more similar to a plant viroid than a complete virus. Additionally, other viruses which can cause hepatitis were found in recent years, involved hepatitis G/GB virus, TTV（transfusion transmitted virus), TMLV（TTV-liked mini virus）and SEN virus. Recent researches for the pathogenic characteristics focus on viral mutations, genotypes and quasispecies distribution in the infected individuals. In methodology, traditional forward genetics has been combined with reverse genetics, applying gene mutated viruses, gene knockout or knockdown techniques in looking for new hepatitis viruses as well as analyzing the viral genetic structures and functions.
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目前，比较明确的肝炎病毒有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。此外，其他病毒如巨细胞病毒、EB病毒、黄热病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、柯萨基病毒、ECHO病毒等也可致肝脏损害，但它们主要引起肝外的临床表现，故不在病毒性肝炎病原讨论范围。近年来又发现一些可引起肝脏炎症的病毒，HGV/GBV-C、TTV、TLMV和SEN病毒等，分别讨论如下。
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1．甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus, HAV)
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HAV属小RNA病毒科，曾归类于肠道病毒属72型。但随后的研究表明，HAV的许多特性与肠道病毒属成员不同，主要表现在以下几个方面：①HAV核苷酸和氨基酸序列与其他肠道病毒不同。②HAV很难适应于细胞培养，复制慢且无细胞病变。③HAV对温度和药物等有抵抗，而其他肠道病毒则敏感。④HAV在pH1时稳定。⑤HAV只有一个血清型。⑥肠道病毒特异性单抗不能与HAV反应。据此现将其归为小RNA病毒科的一个新属——肝病毒属（hepatovirus)。
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HAV为正20面体立体对称球形颗粒，直径为27～28nm，无包膜。颗粒中包含病毒核酸，为线状正链RNA分子。病毒衣壳则由多拷贝的病毒3种多肽，即VP1、VP2和VP3组成。
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HAV基因组是一条长约7.5kb（HM～175株为7478nt）的线状正单链RNA, 具有感染性。基因组结构主要分成5’非翻译区－P1区－P2区－P3区－3’非翻译区－多聚A尾等部分，其中P1、P2和P3区合称为翻译区，分别编码不同的结构蛋白和功能蛋白（图9-1）。
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图9-1 HAV基因组结构（刘克洲、陈智主编：《人类病毒性疾病》P.808）
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5’非翻译区（5’NTR）全长为734nt, 是HAV基因组中最保守的区域。其中151～734nt为HAV IRES（internal ribosomal entry site）元件，在宿主细胞性蛋白多肽作用下，40S核糖体亚单位与HAV IRES元件结合，以“非帽依赖方式”(Cap-independent translation manner）在合适的起始密码处起始翻译。核糖体RNA与HAV的IRES结合，是病毒蛋白翻译的必由之路。如果这种结合不能正确和有效地进行，将严重阻碍病毒蛋白的表达。
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3’NTR在HAV毒株间差异较大，达20％，其功能不明，可能与HAV RNA合成调控有关。
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HAV翻译区位于第735～7415nt, 以单顺反子的形式翻译约含2225个氨基酸的多聚蛋白。该区可分成P1、P2和P3三个功能区，分别编码结构蛋白（P1区蛋白）和两个非结构蛋白（P2和P3区蛋白，转录和调控蛋白）。
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HAV只有一个血清型，但可根据其核苷酸序列分成7个基因型（genotype)，型间差异为15％～25％。基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ仅来源于人，Ⅲ型则来源于人或猿猴，Ⅳ、V、和 Ⅵ仅来源于猿猴。目前世界上流行或散发的人源HAV株绝大多数为基因Ⅰ型（IA和IB)，约占80％，少数为基因Ⅲ型（ⅢA和ⅢB），其他型极少。
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HAV在感染者体内呈准种（quasispecies）分布。准种是指遗传学上高度相关、个体之间又有差别的种群组合。感染者体内的HAV虽为同一基因型，但各自的基因组核苷酸序列又有差别，尤其是在VP1和VP3区，这种序列差别尤为明显，成为一群混合体，其构成可随疾病进展和药物治疗而变化。
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HAV在肝细胞内复制。脱去壳蛋白后，病毒RNA进入细胞质并与细胞核糖体形成多聚核糖体，然后将HAV的RNA翻译成一个多聚蛋白。多聚蛋白经自身或细胞蛋白酶的裂解而产生病毒的成熟蛋白质。其中HAV的RNA依赖性RNA聚合酶将病毒正链RNA复制成负链RNA, 形成复制中间体。以负链RNA为模板复制产生多条正链RNA分子。子代RNA分子与核壳蛋白结合包装，形成完整病毒颗粒。
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HAV的抗原性不仅取决于抗原蛋白的一级结构，且与其立体构型有关。只有完整病毒颗粒或空衣壳（无RNA的病毒样颗粒）或五邻体才能激发产生中和抗体，而纯化的壳蛋白或合成多肽产生的抗体中和能力很弱或几乎没有，除非能形成类似病毒的立体构型。HAV VP3和VP1构成其主要中和抗原决定簇，VP2也可能参与抗原性的形成。
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2．乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus, HBV)
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HBV与鸭肝炎病毒（DHBV)、土拨鼠肝炎病毒（WHBV）和地松鼠肝炎病毒（GSHV）归为嗜肝DNA病毒科（Hepadna Viridae)。
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（1）形态和结构 HBV为直径42nm的球形颗粒，称Dane颗粒。由双层衣壳和核心组成。外层衣壳为包膜（envelope)，由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）组成。内层衣壳为核壳（nuclear capsid)，由乙型肝炎核心抗原（HBcAg）组成。核心（Core）内有双股部分环状DNA和DNA多聚酶。电镜下HBV感染者血清中可见三种不同形态的颗粒：直径22nm的小球形空心颗粒、宽22nm，长40～100nm的管状颗粒（以上两种颗粒均不含病毒的核酸）和直径42nm的双层球形颗粒，内含病毒核酸，称Dane颗粒，即为HBV颗粒。
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基因组的结构、功能及其编码蛋白 HBV基因组为部分环状双股DNA, 由正链和负链组成，负链为长链，呈闭合型的环状DNA, 全长约3200个核苷酸，有转录和翻译蛋白的功能。正链为短链，呈半闭合型的环状DNA, 全长为负链的50％～75％，与负链以碱基配对方式结合成双股DNA。正链没有转录和翻译的功能。负链5’端有11个碱基组成的重复序列称为DR1。同样，在正链5’端也有11个碱基组成的重复序列，称为DR2。DR1和DR2是HBV DNA成环和病毒复制的关键区域，与病毒复制有关（图9-2）。
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图9-2 HBV基因组结构（李梦冬主编：《实用传染病学》第二版，P.106）
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HBV负链DNA有S、C、P和X4个开放读框区（open reading frame, ORF)。S基因区：全长为1167bp。由S基因、前S1和S2基因组成，分别编码226个氨基酸的S蛋白或主蛋白（major protein）即HBsAg、108个和55个氨基酸的前S1蛋白和前S2蛋白。前S2蛋白和S蛋白结合称为中蛋白（middle protein)。前S1蛋白、前S2蛋白和S蛋白结合称为大蛋白（large protein)。大蛋白、中蛋白和主蛋白均是构成HBV外膜的成分。HBsAg可以有 a、d/y和r/w抗原决定簇，故可以分为多个亚型。a抗原决定簇为组中和抗原决定簇，对各个亚型有交叉保护作用。C基因区：包括前C基因和C基因，全长636bp。其中前C基因为87bp, 编码29个氨基酸的信号肽（signal peptide)。C基因为549bp, 编码183个氨基酸的乙型肝炎核心抗原（HBcAg)。从前C基因开始编码，连续编码至C基因，可以产生乙型肝炎 e抗原（HBeAg）前体蛋白，由信号肽引导至细胞内质网，在前C区蛋白氨基端除去19个氨基酸和C蛋白羧基端除去富含精氨酸区而形成HBeAg。P基因区：是HBV基因组最长的开放读框区，与S基因区和部分C基因及X基因区重叠。全长2496bp, 编码832个氨基酸的P蛋白，具有DNA多聚酶、逆转录酶和RNA酶H活性。在HBV前基因组RNA逆转录为负链HBVDNA须要逆转录酶（DNA多聚酶）作用。X基因区：全长为462bp, 编码含154个氨基酸的乙型肝炎X抗原（HBxAg)。