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于是,几个星期后,塞斯特公司CEO辞职,PCR的专利权转让给了罗氏公司。这仍挽救不了公司的颓势,1991年,希龙公司(Chiron Corporation)收购了塞特斯公司。继续投入资金后,1992年,IL-2终于获批在美国上市,商品名为Proleukin。随后,罗氏、葛兰素公司都开发了自己的IL-2产品。2006年,诺华公司收购了希龙公司,并在2010年把IL-2卖给了普罗米修斯实验室(Prometheus Laboratories)公司。
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在成功把IL-2推上市后,希龙公司又收集了干扰素的资料,把IFN-β1b的研究继续下去,发现它对治疗多发性硬化症(multiple sclerosis)有效果,于是1993年,IFN-β1b也得以上市。德国的先灵公司在更早的时候就把IFN-β1b推向了市场。
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另外,开发干扰素的还有百健(Biogen)公司。该公司于1978年在瑞士日内瓦成立。创立者中包括英国爱丁堡大学的肯尼思·默里(Kenneth Murray)、MIT的菲利普·夏普(Phillip Sharp)、哈佛大学的沃尔特·吉尔伯特(Walter Gilbert,首任CEO,成就包括优化基因测序方法,纯化乳糖操纵子,描述基因的外显子和内含子等)和苏黎世大学的查尔斯·魏斯曼(负责第一个产品:干扰素αinterferon alpha)。吉尔伯特因对基因序列的研究获得1980年诺贝尔化学奖,夏普因对游离DNA的研究获得1993年诺贝尔生理学或医学奖。
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2003年百健公司与圣地亚哥的艾迪公司(IDEC Pharmaceuticals)合并为百健艾迪公司(Biogen Idec.)。现在又重新改为百健(Biogen)公司。
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上天眷顾细心的眼睛:链激酶的发现
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约翰·霍普金斯大学的副教授威廉·史密斯·蒂利特(William Smith Tillett,1892—1974,他于1930年与同事还发现了一种与肺炎球菌C-多糖反应的蛋白,即C-反应蛋白)在研究心肌梗死时,发现溶血链球菌在人的血浆中发生凝集现象,但在人的血清中却不会凝集。这一细节吸引了蒂利特的注意。
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蒂利特认为这是由于血清中缺少了某种因子导致的,即纤维蛋白原。他设想,溶血链球菌把纤维蛋白原吸附于自身表面激活,所以发生凝集。那么当血浆中的纤维蛋白原被链球菌吸附后,血浆便不会凝结。于是他设计实验进行验证。
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他首先把血浆草酸化,没有了钙离子,血浆不会凝块。然后在对照试管中加入钙,其余试管中加入溶血链球菌和钙,不过,实验结果是:所有试管里的血浆全部凝结了。
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蒂利特有些失望,但保留了这些试管,不时前来观察一下有无变化。在他决定处理前最后一次观察时,发现有一个加入了溶血链球菌的试管血凝块开始溶解了。于是他推翻了自己的原先设定,认为这是由于溶血链球菌分泌了某一物质引起的血凝块溶解。
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他们研究了不同动物和人的血浆,以及不同菌株进行交叉比较研究,终于在1933年发现了溶血链球菌果然分泌了一种可以溶解纤维蛋白原的物质,但这一反应特异性非常强。1934年,蒂利特分离了这一物质,并指出这是一个蛋白酶。
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立达实验室(Lederle Laboratories)公司跟进,并于20世纪40年代开始支持本品的临床试验研究,但最终因工艺问题于60年代放弃这一项目。不过,欧洲贝林公司在40年代就开始生产这一物质。经过长期的研究,贝林公司推出了这一产品抗凝结药链激酶,商品名溶栓酶。一项对588名患者,另一项对268名患者的临床验证,把链激酶直接注入冠状动脉,可以溶解血栓。尤其是血管栓塞的最初几个小时,本品能提高生存率。
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蛋白质链激酶在萃取后要彻底净化,但是这种药剂有时会引起过敏反应,因为接触过链球菌的人会在血清中保留相应的抗体,从而导致过敏。而尿酶,可以同样溶解血栓,却没有过敏风险,因为这种物质在肾脏中产生,并出现在尿液中。立达实验室公司放弃链激酶的一个原因就是他们转而开发尿酶。但最初的尿酶是从尿液中提取,所以要900升尿才提取出一个治疗剂量,生产成本很高。
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来自水蛭的抗凝药:重组水蛭素的发现
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1884年,约翰·贝里·海克拉夫特(John Berry Haycraft)从水蛭中发现一种抗凝物质,他称为水蛭素(hirudine)。但这种物质提取不易。基因工程出现后,水蛭素就可以通过基因重组的办法很容易生产出来。两种重组水蛭素乐匹卢定(lepirudin,拜耳公司推出)和地西卢定(desirudin,瓦利安特制药推出)很快被推向市场。而水蛭素的类似物和比伐卢定(bivalirudin)等也被积极开发。
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现在通过酵母发酵生产的水蛭素比天然水蛭素在63位酪氨酸少一个巯基,使副作用大大减少。乐匹卢定还可以治疗肝素引起的血小板减少症。但由于出血等副作用,拜耳公司已经不再生产乐匹卢定了。
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地西卢定效果要好得多,曾有临床对比实验显示,地西卢定治疗静脉血栓比依诺肝素钠(低分子量肝素)效果好。
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大肠杆菌基因重组表达系统遇到障碍:重组组织活化遗传因子(tPA)的发现
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1976年,加州大学教授赫伯特·博耶(Herbert Boyer)与投资人罗伯特·A.斯旺森(Robert A. Swanson,1947—1999)联合成立了基因泰克(Genentech)公司,他们首先用大肠杆菌(E. coli)进行基因工程蛋白表达,先后成功地实现了生长抑素(somatostatin)和胰岛素的生产。
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生长抑素是基因泰克的第一个产品,博耶采用化学合成的方法,得到了生长抑素的基因,然后导入到大肠杆菌表达系统中。这是第一个表达合成基因的药品。
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奥曲肽(octreotide)是诺华公司生产的生长抑素类似物。它对生长激素、胰岛素和胰高血糖素(glucagon)的抑制作用比天然激素要强得多。它于1979年由化学家维尔弗里德•鲍尔(Wilfried Bauer)首先合成,可用于治疗出血或其他内分泌疾病,也取得了极大的市场销量,但毕竟与艾塞那肽一样,属于化学合成药物。
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生物抑素的完成给基因泰克公司很大的信心,他们更加努力地投入到胰岛素的生产当中。当时百健公司的沃尔特·吉尔伯特也在进行胰岛素的基因工程表达。两个公司之间展开了竞争。不过基因泰克公司使用单链表达后再采用“杜-邹”法进行化学合成,而不是单纯的整个基因表达,结果避开了百健公司遇到的工艺难题。
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接下来,基因泰克公司把目标瞄准了组织活化遗传因子(tissue plasminogen activator,tPA)。这种物质存在于人体组织中,不过量很少,临床上可用于治疗栓塞或血栓性卒中。
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基因泰克公司把tPA基因分离出来后,用相同的办法,插入到大肠杆菌表达系统,但得到了纯度非常低的产物。研发人员之一丹尼斯·克莱德(Dennis Kleid)反复尝试了很多遍,得到的结果仍不理想。科学界原以为通过大肠杆菌这种原核细胞可以表达非常多的蛋白质,但这一想法遇到了挫折。生长抑制只有14个氨基酸,人胰岛素共有51个氨基酸,但tPA有527个氨基酸,并且有大量糖基化位点。大肠杆菌表达人胰岛素尚且遇到困难,更不要说tPA了。另外,大肠杆菌难以进行糖基化,所以蛋白无法顺利折叠,也就起不了相应的作用。
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1980年,基因泰克公司在用大肠杆菌表达HBV蛋白(生产疫苗用)时也遇到了困难,因为这一蛋白本身会抑制大肠杆菌的繁殖。为此,加州大学的阿瑟·莱文森(Arthur Levinson)被招募进公司,第二年,他开发成功了一个猴肾细胞表达系统。
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