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1873年，科赫搬到沃尔施泰因还不到一年，当地的绵羊接连死亡。更糟糕的是，农民和剪羊毛的工人也开始生病。这个地区的居民对这种疾病太熟悉了——毛工病，也称为炭疽，常见于食草动物如牛、绵羊、马、山羊和羚羊，但人类如果接触了受到感染的动物组织，那么也有被感染的风险。牛羊感染的临床特征可以概括为突然发作、快速死亡，并伴有行走摇摆、呼吸困难、寒战、昏倒甚至抽搐症状。[37] 身体的开放部位如口、鼻、肛部偶尔会流出血性分泌物。人感染这种疾病后，皮肤会出现大面积溃疡和坏死，经常发展出黑色的病变。自古以来，人们将炭疽理解为一种天谴或圣经中出现的瘟疫，恐怖至极，无法解释。
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随着疫情在1874年夏天波及人类，大量的病人开始涌入科赫在沃尔施泰因的住宅，他很可能使用了民间疗法为出现红肿结痂的病患进行治疗。身为科学家的科赫从被感染的病人身上收集血液和脓液样本，在一楼临时搭建的实验室里，通过显微镜对受试对象的样本进行检查，并在个人研究笔记本上记录下他的发现。1874年4月12日，他开始在笔记中使用“细菌”（bacteria）一词，效仿了德国动物学家克里斯蒂安·戈特弗里德·埃伦贝格对细菌的称呼。“细菌膨胀起来，变得更亮、更厚、更长。”[38] 科赫的观察反映出在那之前几年里研究人员的发现，但是，没有科学家进行下一步 研究，没有人评估那些像谷粒一样首尾相连的细菌，是不是炭疽的原因 。
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18个月后，1875年圣诞节前的某一天晚上，沃尔施泰因当地的一名治安官出现在科赫的家中，他带着一部分动物残骸，应该是装在马车上拉来的，动物尸体上流着浓稠的黑血。这名警官害怕这只死去的野兽会使炭疽疫情卷土重来，于是带着动物残骸来找镇上可能知道下一步该怎么处理的人。
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罗伯特·科赫查看了一下动物尸体，立刻想到他的显微镜是最佳的分析工具。科赫预感这只野兽应该是感染了炭疽，于是他急切地从死去的动物身上抽血取样，然后将样本放在显微镜下进行检查。这位蓄着胡须、戴着眼镜的32岁医生开心地发现，玻片上布满的细菌与自己一年前所观察到的细菌类型一模一样。“如果能够将有传染性的生物和有传染性的液体分离，并观察其威力，就可以用实验证明［细菌］实际上是起作用的（是疾病的原因）……”[39] ——雅各布·亨勒曾经的梦想在耳边回荡，科勒的脑海中灵光一现。
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离开临时搭建的实验室，科赫走出后门来到花园，从笼子里拽出一只健康的兔子。他把兔子控制住之后，切开了兔子的耳朵，将一滴深红色的血滴在载玻片上，并通过显微镜证实兔子的血液中没有细菌。然后，他将死亡动物身上载满“微动物”的血液注入健康兔子的耳朵。当时的人们还完全不知道细菌的生命周期，甚至还没有对病菌是否真的存在达成共识，更不用说去理解其活动模式和致命性了。那天晚上，科赫躺在床上，不知道第二天的平安夜会得到什么消息。
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以科赫一心一意的性格和执着的专注力，我相信那个晚上他一定辗转难眠。24号那天，诊所人满为患，科赫在楼上的检查室中照顾病人，虽然可以看到后院关着兔子的地方，但他从早忙到晚。下班后，他去检查那只兔子病患。
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兔子死了。
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科赫把兔子带到屋里，对血液进行了取样，在样本中发现了与自己前一天看到的相同的细菌。在研究笔记中，他描述道，这种完全相同的细菌数量为“中等”。那个平安夜，躺在床上的科赫像所有满怀期待的孩子一样，计划着自己的下一步实验。他没有丢掉那只兔子的尸体，而是将其保存下来，以便第二天进行更多的实验。
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圣诞节的早上，科赫从死去的兔子身上采集了更多的组织样本，毫无疑问，尸体已经开始发臭了。毕竟那是19世纪70年代，还没有电、灯泡和冰箱。科赫发现样本中长出的细菌越来越多，于是他更加确信，这些成倍增加的生物是炭疽出现的原因。他不仅在笔记本上记录了观察结果，还开始安排实验来验证自己的假说，证明这些平平无奇的微型生物体是疾病的元凶。
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科赫使这种疾病由兔子传给家中饲养的小老鼠等其他小动物。每种动物都死于炭疽，每个样本在显微镜下都能看到有问题的细菌。不知不觉中，科赫为动物实验树立了典范：他使用兔子和小老鼠进行的实验，包括他的小白鼠饲养方案，从小镇沃尔施泰因悄然进入全世界的每一所大学实验室中。
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在进一步的实验中，科赫开始尝试在宿主体外培养炭疽病细菌。毋庸置疑，这位医学先驱对炭疽疫情一阵接一阵的暴发感到困惑。其中有什么秘密，使这种生物能够在平静数月或数年之后，又快速地传播开来？罗伯特·科赫正在驶入未知海域。少数有远见的科学家曾经怀疑过，显微镜金属筒另一端那些看起来无害的病菌实际上作恶多端，但是，他们从未成功地培养过病菌。
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科赫已经确信，细菌是需要营养供给的生物，于是他开始寻找能够作为培养基的体液。最后的解决方案有些恐怖：他选择了房水，即眼球含有的液体，他所用的房水来自屠宰场的牛。科赫使用解剖工具从受到感染的老鼠脾脏上采集了一小份样本，在一块薄薄的载玻片上，将样本与房水混合。他预先在一片比较结实的载玻片上磨出了一小块凹槽，然后他将这两片载玻片合放在一起，并在周围涂抹一圈凡士林，将液体混合物固定其中，这样就形成了一个密封的培养环境。
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科赫将自己发明的小装置放在蔡司显微镜的载物台上，调节凸出的大号铜制聚焦环，窥看液体混合物，结果什么也没有发现。他小心翼翼地扫过玻片，但是找不到任何细菌。等了一个小时之后，他焦急地回来观察是否长出什么东西，然而还是没有任何变化。两个小时后，科赫再次检查，又一次失望而归。几个小时过去了，科赫终于看到了美妙的一幕：如米粒般成堆的螺旋杆状物开始出现。他渐渐感到自己眼睛所见的整个世界都充满了炭疽细菌，科赫称之为“炭疽杆菌”（Bacillus anthracis ）。
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随着炭疽杆菌的成熟，菌落开始呈现出不同的形状。科赫观察到，长条形的杆菌会随着时间的推移逐渐增大，之后生出小的圆形“孢子”，布雷斯劳大学（现波兰弗罗茨瓦夫大学）的费迪南德·科恩（Ferdinand Cohn）刚刚就此做过报告。科赫的突破在于接下来的一系列实验。他开始变换培养环境。他已经用房水成功培养了细菌，但也许是出于偶然，现在科赫开始思考干燥或者加热培养样本所产生的影响。他通过加热把培养出来的炭疽杆菌菌落进行干燥，然后注意到杆菌和孢子会停止生长。他把杆菌再次放回培养基中，没有发生任何变化，它们显然已经失活，从而丧失了传染性。科赫发现，这种杆状物显然并非造成传染病蔓延的细菌主要形态。但是孢子对温度和湿度表现出很强的适应性，一旦放回培养液中，它们便可以立即复活，生长出新的致病杆菌和孢子。科赫推断，炭疽杆菌的孢子形态能够以假死状态在田野中存活数年，等待在一只动物身上重获生机，食草动物便是这样感染炭疽的。他解开了炭疽杆菌的生命周期之谜。
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这位沃尔施泰因的医生兼科学家知道自己的研究非常重要，但是他生活在与世隔绝的普鲁士小镇，不确定应该与谁取得联系。最后，科赫联系了费迪南德·科恩。科恩邀请科赫到布雷斯劳展示他的实验成果。不出几日，科赫便“向火车站出发了，他带着显微镜、玻片、牛眼、老鼠的脾脏以及成箱的兔子、青蛙和老鼠——许许多多的老鼠，有活的也有死的。有些动物感染了炭疽，通体发红。科赫带着大包小包，一路匆匆穿过沃尔施泰因火车站赶火车，他肯定是一道独特的风景线”。[40]
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一到布雷斯劳，科赫就立刻在科恩的研究所里设置仪器、接种动物、在房水中培养细菌。在接下来的几天里，一些科学家前来拜访他，测定实验进度，评估科赫细致的技术。杆菌和孢子很快就出现在培养基中，动物轮番病倒。受人尊敬的尤利乌斯·科恩海姆（Julius Cohnheim）教授前来查看实验进度，他是病理学研究所所长，以前是菲尔绍在柏林的助手。科恩海姆“对这位科赫过目难忘，他工作起来条理清晰、细致缜密。科赫名不见经传，却冷静地展示着实验技术，那是科恩海姆所见过的最娴熟利落的手法”。[41]
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对科赫大为赞叹的科恩海姆教授离开了临时搭建的实验室，匆匆穿过校园找到自己的助手们，告诉他们放下手里的工作，去科赫的实验室，亲眼见证那位奇才所做的展示。他这样说道：“我认为这是细菌研究领域有史以来最伟大的发现。我相信这不会是年轻的罗伯特·科赫最后一次展示其卓越的研究和惊艳的技艺，他让我们自愧不如。”[42]
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不久之后，科赫就出版了自己关于炭疽的研究。在接下来的几年中，他又通过一系列的实验和文章证实了伤口中存在细菌，从而支持了利斯特在外科学领域提出的“消毒”观念。他先在沃尔施泰因，后来在柏林继续改进培养技术。如今世界各地的每家医院和每间实验室每天都在使用这些技术，包括使用琼脂作为培养基。培养技术所使用的圆形玻璃盘器皿，就是以科赫的助手尤利乌斯·佩特里（Julius Petri）命名的培养皿（Petri dish）。科赫还与蔡斯公司一起改进了显微镜，与徕卡公司合作发明了显微照相术，这本身就是巨大的成就。
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1882年3月24日，科赫达到了个人事业的巅峰。作为全欧洲最伟大的创新青年之一，38岁的科赫宣布，自己将开办一场题为“论结核病”的讲座。在过去的十年中，尽管病菌理论得到了一些巩固，但医学领域仍然没有就结核病的起源问题达成共识，包括鲁道夫·菲尔绍在内的最伟大的医学天才们观点也不尽相同。讲座的重磅消息在柏林的业内人士之间流传开来。周五晚上，柏林大学生理学研究所的图书馆爆满。大家都期待着科赫的展示。
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科赫首先回顾了结核病在19世纪的统计数据：1/7的人类死于结核病，然而，“如果仅考虑有劳动能力的中年群体，结核病带走了其中1/3的生命，甚至可能更多”。[43] 结核病的确是一种缓慢传播的世界性流行病，他的听众们陷入了对现实的思考。他越是强调这一疾病的重要性，听众们就越是期待他给出一个深刻的结论。问题在于，人们还从未见过这种病菌的模样。
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结核病具有近乎无情的隐蔽传播效率，这也是人们无法获得其图像的原因之一。现在大家都知道结核菌属于“分枝杆菌”（mycobacterium ），这个菌属包含150多种细菌，包括导致麻风病的麻风杆菌，以光滑的、具有疏水性的厚细胞壁为特征，不易被水沾湿。厚厚的细胞壁帮助小巧的杆菌[44] 隐藏在细胞的海洋里，不易被常见的组织染色剂着色。直到科赫及其研究团队改用其他化学物质，并通过变换环境条件，捕获他的猎物，情况才发生变化。
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科赫和他的同事们准备好结核组织样本块，使用新发明的切片机，将组织样本块切成极薄的样本切片，并将它们嵌入载玻片。常规的做法是，在室温条件下将玻片暴露于亚甲基蓝乙醇溶剂中染色，但是这种方法对结核菌无效。科赫试验了许多试剂，几经失败后，他终于找到了一种方法，加入氢氧化钾和一种名为俾斯麦棕（Bismarck brown）的工业棕色染料，对周围组织复染。同时他将玻片加热至40摄氏度，反应时间就缩短到一个小时，从而使这种化学反应法进一步完善。
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大约400年前，驶往新大陆的第一批航海者一面向西航行，一面从望远镜中寻找着新的陆地。那种通过望远镜远远地看到一块陆地的影子所带来的难以言表的喜悦之情，都比不上在柏林实验室里低头注视着显微镜的罗伯特·科赫心花怒放的感受。他利用新技术，看到了一列栗色的组织，在干酪样结节中间，赫然散布着蔚蓝色的杆菌。[45]
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科赫站在柏林大学生理学研究所的讲台上，面对在座的天才们，身旁放着预先准备好的显微镜、玻片、试管和培养皿，他宣布自己看到了人类的敌人。他冷静地声明，更重要的是自己已经培养出了结核菌。
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科赫没有在液体培养基中培养这种需要认真对待的细菌，他选择了凝固的牛血清或羊血清。他将血清加热后倒入倾斜放置的试管中，以增加菌落生长的面积，然后向试管中注入小批量被分离出来的结核菌样本，将温度设置在37摄氏度，也即人体体温，再监测菌落的形成。接下来，他把培养出来的结核菌接种在实验室的豚鼠身上，10~14天后，这些豚鼠就会献出生命，它们的肺部组织将用于显微镜检查。
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