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血吸虫病肝纤维化的研究已证实彻底祛除原发病因与肝纤维化治疗即吡喹酮+IFN-γ，可使肝窦毛细胞化逆转到正常，但要早期，晚期则有困难。
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3．肝纤维化与肝癌发生有一定的关系
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1995年日本报道，在2年内登记的3017例肝癌病例，正常肝组织仅有7％，余均有肝纤维化／肝硬化。坂井田等采用无胆碱的氨基酸饲料，大鼠肝癌发生率达90％，而加用HOE077（脯氨酸羟酶抑制剂）大鼠为50％，仅通过抑制肝纤维化就能降低肝癌的发生率。病理学家希望通过对肝纤维化形成机理的进一步了解，为防治肝癌提出一条新的途径。Elsharkawy等（2007年）进一步阐明了肝脏炎症→纤维化→癌（inflammation→fibrosis→cancer）轴线之间的关系。还指出NF-κB在其中起重要作用，为今后治疗提供新依据。Bergamini等研究指出间质成分的层黏连蛋白（LN）与通过整合素刺激肝细胞癌的生长。Friedman（2008）对肝纤维化分子生物学的了解关键不仅在于开发有效靶向性抗肝纤维化治疗，还在于了解肝脏肿瘤的发生。
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4．祛除病因治疗，不能代替抗肝纤维化治疗
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近来研究证实单纯的祛除病因不能使肝纤维化→肝癌发生完全中止，第三次美国肝纤维化专题会议提出抗病毒治疗的同时进行抗肝纤维化治疗，2008年NIH已组织这方面研究，对HCV致肝硬化患者，在抗HCV治疗的同时抗肝硬化治疗。血吸虫病肝纤维化从动物实验、临床、现场大规范的随访研究证实，已有肝纤维化者单纯杀虫治疗，肝纤维化仍可进展。在理论方面早已阐明，主要是活化的HSC可以通过自分泌与旁分泌机理再活化HSC。
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三、ECM基因调控失调导致肝纤维化的发生与发展
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（一）ECM的组成与合成
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目前常将细胞外间质与ECM视为同义词。在形态学上，基质是指不包括纤维的极其复杂的凝胶或溶胶，在常规电镜与光镜下不能看到。ECM的组成为纤维和基质，基质包括非胶原结构的粘连糖蛋白如LN, 和蛋白多糖如HA。亦有人将基质金属蛋白酶（MMPs)、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）及ECM受体（整合素）纳入ECM内。以往对肝纤维化研究集中在胶原、层黏蛋白、纤维连接蛋白和透明质酸等ECM的合成方面，近年来更重视对ECM降解的研究，例如研究MMPs和TIMPs。
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目前已知胶原的基因型有30多种，编码的蛋白质有19种，用罗马数字表示，这些胶原蛋白有不同的肽链结构、免疫特征与体内分布。胶原蛋白占人体蛋白总量的1/3，占肝内蛋白总量的1/20～1/10，当肝脏发生纤维化时胶原蛋白可增加到50％左右，主要是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ、ⅩⅥ、ⅩⅧ型8种胶原，肝脏中胶原以纤维形式存在，每一条纤维可能由多种胶原混合而成。胶原的合成是一个复杂的过程。胶原基因由RNA多聚酶Ⅱ转录形成mRNA, TGF-β能够刺激胶原基因复制并使转录形成的mRNA保持稳定。mRNA经加工并转运至粗面内质网，翻译合成前α-肽链，其中脯氨酰、赖氨酰残基经相应的羟化酶作用生成羟脯氨酰及羟赖氨酰，羟赖氨酰在糖基转移酶的催化下糖苷化，形成半乳糖羟赖氨酰及葡萄糖半乳糖基羟赖氨酰，3条前α-肽链的羧基端间相互作用形成三螺旋结构的前胶原，从内质网转运到高尔基复合体，通过分泌系统经微管排出细胞外。再经氨基N端和羧基C端肽酶作用切除N端及C端肽形成原胶原，在赖氨酰氧化酶作用下，微纤维聚集（可溶性），经交联成不溶性纤维，此仍可在胶原酶和肽酶的作用下降解成肽和氨基酸。胶原基因在肝脏的表达已有较多报道。笔者等（2002年）对日本血吸虫感染新西兰兔肝脏内Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原mRNA水平进行了较系统的动态观察，用RT-PCR加Dot blot法检测胶原mRNA水平，以β-actin作内对照。与正常兔肝比较，感染第4周，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原mRNA水平增高分别为10.5、11.7和6.6倍；感染第10周时达高峰，分别为12.0、11.9和6.6倍；感染第16周骤降，第28周三者mRNA水平均下降至2倍左右，但降解明显减少。原位杂交研究认为胶原、蛋白多糖和非胶原糖蛋白主要来源于HSC。枯否细胞（KC)、内皮细胞（SEC)、成纤维细胞、胆管细胞及HC可能不是合成ECM的主要细胞。
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但有人认为尽管HC生成ECM少，但其细胞数量大，在肝纤维化中的作用也不可忽视。近认为MFB来源较多，MFB的多源性笔者已综述，认为正常肝脏不存在MFB, 正常情况下HSC存在于Disse间隙，成纤维细胞在门静脉结缔组织及肝小叶中央静脉周围。在肝纤维化时，已有较多研究证实这些细胞可转化为MFB, 另研究认为骨髓间质干细胞可分化为HSC, 转化为MFB, 也可直接转化为MFB, 胆管上皮细胞（BEC）转化为MFB, 上皮细胞转化为间质细胞（epithelial-mesenchymal transition, EMT)，已被认为某些器官纤维化纤维生成细胞增加的重要途径，周围血循环中的单核细胞与肝细胞也可衍生成MFB。近研究显示门脉的成纤维细胞（portal fibroblast）与HSC不同，通过desmin染色可区别，体外培养10～14d才转化MFB, 在TGF-β和坚硬的基质（在聚丙烯酰胺维持下）培养下，可转化为MFB。Zisberg等研究证实在CCl4诱导肝纤维化鼠中，成熟鼠的肝细胞在TGFβ1的诱导下，经上皮类型表型与功能改变，转化为MFB。此受骨形态发生蛋白（骨形成蛋白）-7（BMP-7)（又称生骨蛋白）和骨性蛋白（OP-1）的调节。肝脏的MFB至少来源肝内HSC、BEC和肝细胞。MFB的主要标志为纤维细胞特异蛋白1（FSP1）和α-SMA, MFB也有可能转化为上皮细胞此称MET, 能否再演变为肝细胞均待研究。MFB的多源可能与不同病因的肝纤维化有关。
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人们特别重视肝纤维化肝细胞转化MFB, 此已有较多研究，翁红雷等已有报道IFN-γ治疗9个月后肝纤维化患者肝细胞表达上调抗肝纤维化因子Smad7，下调Smad3与CTGF等促肝纤维化因子。为考核疗效提供了新的方法。
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（二）ECM的降解
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肝纤维化时胶原纤维在肝脏增加显著，其降解对肝纤维化恢复正常起决定作用。既往以为胶原降解主要在细胞外进行，近发现大约15％～30％（近认为更高比率）新合成的胶原，合成后数分钟在细胞内降解，可能是在内质网和溶酶体内的酶参与其降解。细胞外降解主要经过胶原酶的作用，将三螺旋的胶原分子裂解为原分子长度的3/4和1/4两个片段，较大的片段可被巨噬细胞吞噬，在溶酶体内降解成较小片段；而较小的片段在体内很快自发性变性，在明胶酶等酶的作用下降解成寡肽或氨基酸，一部分被重新利用，一部分如羟脯氨酸（Hyp）随尿液排出。参与胶原降解的胶原酶主要MMPs。1989年在美国佛罗里达州举行的MMP专题会议上，确定以阿拉伯数字将其名称系统化，系统命名为MMP-1, MMP-2. MMP-3…MMP在组织中浓度很低（1～10μg/g组织），与间质结合紧密，具有活性的MMP难于从组织中提取出来，在哺乳动物的众多MMP之间氨基酸序列仅有50％左右的同源，利用cDNA作探针时需考虑种属之间的交叉性。
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1．MMPs的生化特征与分类
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MMPs是参与ECM降解的主要酶家族，目前已发现至少有25个成员。MMPs以酶原形式分泌，对钙离子和锌离子有活性依赖性。根据底物的特异性，MMPs主要分为5个功能亚型（表3-2）。
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表3-2 MMPs分类
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2．MMPs的调节
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（1）MMPs合成调节：①MMPs的合成受到多种细胞因子、生长因子和激素的调节。研究发现MMPs转录的增强和抑制因子位于MMPs基因的前肽区。TNF-α、PDGF、bFGF、EGF和IL-1对MMPs的表达具有上调作用，而TGF-β1、IL-4则有下调作用；②原癌基因C-jun和C-fos在MMPs的活化中发挥重要作用，可在MMP-1和MMP-3基因的启动子区活化蛋白结合位点结合，增强MMPs基因转录；③与基质结合的整合素也参与调节MMPs的合成，且ECM通过此途径还能调节自身平衡；④基质蛋白降解产物或它们合成的类似物也可通过与细胞膜受体的相互作用来刺激MMPs的表达，此现象不发生在完整的基质分子；⑤巨噬细胞对MMPs合成的调节是由不同机制所介导。内毒素和淋巴因子混合物可以兴奋巨噬细胞。而γ干扰素（IFN-γ）对巨噬细胞合成MMPs起抑制作用。内毒素对巨噬细胞MMPs合成的刺激作用可被皮质类固醇、前列腺素合成抑制剂所抑制。NF-kappa B、激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）等可刺激MMP基因表达。人纤维细胞中原始肿瘤基因C-jun和C-fos参与前胶原酶的基因表达与调节，C-jun的蛋白产物可分为AP-1的成分，基质分解素与间质胶原酶有5′-TGAGTCA-3′，是基因表达与调控区，该区可被AP-1结合，引起信号转录，改变基因转录水平从而调节表达。另外与C-jun和C-fos的蛋白结合亦可达到调节作用。已有报道IL-1、TNF-α增加C-fos和C-jun mRNA水平，继而前胶原酶mRNA逐步增加。此研究也说明在肝纤维化形成的不同阶段，基因表达不同，在诊断与治疗时应考虑不同。
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（2）MMPs活性调节：MMPs酶原的活化细胞分泌无活性MMPs, 通过激活因子作用后，切除胶原酶的前端（即两个单体，10kD）约为80个氨基酸，形成具有活性的酶。现认为主要活化系统是纤溶酶活化系统。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，由纤溶酶原经尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator, uPA）或组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA）催化生成。纤溶酶可部分活化MMP-1和MMP-3，进而导致MMPs的完全活化和超活化。
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抑制MMPs活性的因素：①TIMPs是一类重要的调节细胞外MMPs活性的酶家族，目前已知四种TIMP-1～4，分子量在20～29kD之间，在肝脏中仅发现有TIMP-1和TIMP-2表达。TIMPs可由多种结缔组织产生，在肝脏由KC、HSC及MFB产生，以活化的HSC细胞表达最强，常与MMPs协同分泌，在一定程度上介导MMPs活性的自身调节。TIMPs与等比例的MMPs以非共价键可逆性结合而抑制MMPs活性。TIMP有N末端和C末端基本结构。C末端与MMPs结合，N末端介导对活化MMPs活性的抑制。TIMPs分子内含有大量的二硫键，Cys1和Cys70间的二硫键是抑制MMPs活性的决定性基团。近来研究表明，TIMP既可抑制MMPs活性，也可保持MMPs的稳定性，防止其酶原活化。Bahr等（1999年）研究认为AP-1 DNA结合蛋白具有调节活性HSC中控制TIMP-1的启动子作用。②α巨球蛋白可抑制MMPs的活性。α2巨球蛋白是一个高分子量（725kD）的血浆糖蛋白。可结合抑制间质胶原酶和基质分解素。③纤溶酶原激活抑制因子－1（PAI-1)，通过抑制uPA和tPA而抑制纤溶酶的生成，从而抑制MMPs的活化。④Banda等（2001年）在人肿瘤细胞的条件培养液里，找到一种分子量为16.5kD的MMPs抑制物。这种新的抑制物不是TIMP-1 TIMP-2、TIMP-3的片段。实验证实PCPE（前胶原C端蛋白酶增强物）的羧基片段可能就是这种新一类的MMPs的抑制物。
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（三）ECM代谢的调节
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1999年Gressner总结参与ECM调节的细胞因子即肽类物质有20余种，分别来自肝内细胞，包括HC、KC、SEC、外周单个核细胞（PBMC)、血小板、成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞等。单纯研究体内某一个细胞因子的功能，同时又排除其他因素干扰时，基因敲除（gene knock-out）技术或转基因（transgenic）技术是比较理想的方法。基因敲除技术原理是利用受体细胞基因组内同源序列间发生同源重组的原理，将敲除某一靶基因的载体导入受精卵或胚胎干细胞（ES）后通过同源重组使染色体上的目的基因失活，最终获得不表达目的基因的动物。转基因技术是通过分子克隆的方法将带有目的基因的表达载体直接导入动物受精卵或导入体外培养的ES中，ES细胞注入受精卵发育为四细胞或八细胞囊胚后植入假孕鼠内，最终发育形成的子代个体中的部分细胞将携带有已经整合入染色体的目的基因，再通过近交繁殖，获得纯系转基因动物。转基因可以使某一基因过量表达，从而观察其生物效应。从本质上讲，转基因是基因敲除的逆过程。D’sonza等（1998年）发现敲除了TGF-β1基因的幼鼠因无法控制的感染而死亡，成年鼠则形成播散性炎症，说明TGF-β1具有明显的抗炎作用。Kanzler等（1999年）将TGF-β1基因转入小鼠体内，使其过度表达，结果发现给转基因小鼠皮下注入脂多糖100mg15h后，转基因小鼠血浆TGF-β1可高达600ng/ml, 是正常小鼠血浆TGF-β1水平的100倍，表达高峰期15h后，肝内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA水平显著上升。此与Hellerbrand等（1999年）研究结果一致，后者将大鼠TGF-β1基因敲除，再以CCL4诱导肝纤维化形成，发现TGF-β1基因敲除的大鼠Ⅰ型胶原增加很少，仅为模型组的20％，而将TGF-β1基因敲除后的大鼠给予TGF-β2或TGF-β3转基因治疗，发现Ⅰ型胶原的合成抑制作用不能被TGF-β2或TGF-β3替代。从而得出结论在TGF-β1肝纤维化形成中起重要作用。TGF-β1在肝纤维化形成过程中参与信号传导。Munger等（2000年）发现，TGF-β1分泌后被封闭在前多肽内处于潜伏状态。这种潜伏状态叫做潜伏状态伴随多肽（latenly-associated peptide, LAP)，潜伏状态的TGF-β1在信号传导前必须在细胞外活化。另有人认为，TGF-β诱导基质产生的机制是即通过上调有关产生基质的基因转录，也通过下调有关降解基质的基因的表达。这些活性由细胞内的信号蛋白Smad家族介导。Smad家族是1995年和1996年分别在果蝇和线虫体内发现的，Smad的命名是由果蝇的Mad基因和线虫的Sma基因组合而成。Smad家族是TGF-βⅠ型受体目前已知的唯一底物。TGF-β与细胞表面TGF-βⅡ型受体结合，进而结合TGF-βⅠ型受体，使得I型受体激酶活化，随后Smad2和Smad3的磷酸化（TGF-β受体与Smad蛋白家族结合，使Smad蛋白家族在胞浆内磷酸化）。磷酸化的Smad蛋白再与公共介导物Smad4结合形成复合物，转入细胞核，调节TGF-β应答基因的转录。Tahashi等（2002年）研究认为，在培养的肌成纤维样细胞上TGF-β受体活化并诱导Smad2磷酸化，这一信号传导过程可被Smad7抑制。Schnable等（2001年）指出TGF-β在诱导肝纤维化发生的信号传导过程中，可以是Smad3依赖性的也可以是Smad3非依赖性的。近有报道减少Smad蛋白的表达，可减少TGF-β1介导肝硬化肝细胞生长抑制。多种因子对HSC均有作用，近来发现肝癌细胞亦能分泌致HSC活化因子，使之分泌胶原，在肝癌的癌块周围常有纤维包绕，此可防止癌细胞扩散。
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2008年第163届Falk论坛，Friedman专题报告中，指出HSC的活化是肝纤维化发生发展的中心环节。对这过程分子机制的认识已取得很大进展，主要有：①阐明了关键的细胞因子对HSC和其信号传导通路的影响；②认识了HSC活化的调节；③基质蛋白酶（MMPS）及其抑制剂的特征；③证明凋亡（活化HSC）在肝纤维化消退的重要性并认识到其调节介质；④认识了HSC和ECM之间的复杂性及其动力学相互作用；⑤了解了其他细胞组分在肝纤维化中的作用及其与HSC的相互作用。此外，临床研究已经开始探索宿主的遗传多态性，以便预测肝纤维化的进展的危险性。
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