1700630060
（二）ECM的降解
1700630061
1700630062
肝纤维化时胶原纤维在肝脏增加显著，其降解对肝纤维化恢复正常起决定作用。既往以为胶原降解主要在细胞外进行，近发现大约15％～30％（近认为更高比率）新合成的胶原，合成后数分钟在细胞内降解，可能是在内质网和溶酶体内的酶参与其降解。细胞外降解主要经过胶原酶的作用，将三螺旋的胶原分子裂解为原分子长度的3/4和1/4两个片段，较大的片段可被巨噬细胞吞噬，在溶酶体内降解成较小片段；而较小的片段在体内很快自发性变性，在明胶酶等酶的作用下降解成寡肽或氨基酸，一部分被重新利用，一部分如羟脯氨酸（Hyp）随尿液排出。参与胶原降解的胶原酶主要MMPs。1989年在美国佛罗里达州举行的MMP专题会议上，确定以阿拉伯数字将其名称系统化，系统命名为MMP-1, MMP-2. MMP-3…MMP在组织中浓度很低（1～10μg/g组织），与间质结合紧密，具有活性的MMP难于从组织中提取出来，在哺乳动物的众多MMP之间氨基酸序列仅有50％左右的同源，利用cDNA作探针时需考虑种属之间的交叉性。
1700630063
1700630064
1．MMPs的生化特征与分类
1700630065
1700630066
MMPs是参与ECM降解的主要酶家族，目前已发现至少有25个成员。MMPs以酶原形式分泌，对钙离子和锌离子有活性依赖性。根据底物的特异性，MMPs主要分为5个功能亚型（表3-2）。
1700630067
1700630068
表3-2 MMPs分类
1700630069
1700630070
1700630071
1700630072
1700630073
2．MMPs的调节
1700630074
1700630075
（1）MMPs合成调节：①MMPs的合成受到多种细胞因子、生长因子和激素的调节。研究发现MMPs转录的增强和抑制因子位于MMPs基因的前肽区。TNF-α、PDGF、bFGF、EGF和IL-1对MMPs的表达具有上调作用，而TGF-β1、IL-4则有下调作用；②原癌基因C-jun和C-fos在MMPs的活化中发挥重要作用，可在MMP-1和MMP-3基因的启动子区活化蛋白结合位点结合，增强MMPs基因转录；③与基质结合的整合素也参与调节MMPs的合成，且ECM通过此途径还能调节自身平衡；④基质蛋白降解产物或它们合成的类似物也可通过与细胞膜受体的相互作用来刺激MMPs的表达，此现象不发生在完整的基质分子；⑤巨噬细胞对MMPs合成的调节是由不同机制所介导。内毒素和淋巴因子混合物可以兴奋巨噬细胞。而γ干扰素（IFN-γ）对巨噬细胞合成MMPs起抑制作用。内毒素对巨噬细胞MMPs合成的刺激作用可被皮质类固醇、前列腺素合成抑制剂所抑制。NF-kappa B、激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）等可刺激MMP基因表达。人纤维细胞中原始肿瘤基因C-jun和C-fos参与前胶原酶的基因表达与调节，C-jun的蛋白产物可分为AP-1的成分，基质分解素与间质胶原酶有5′-TGAGTCA-3′，是基因表达与调控区，该区可被AP-1结合，引起信号转录，改变基因转录水平从而调节表达。另外与C-jun和C-fos的蛋白结合亦可达到调节作用。已有报道IL-1、TNF-α增加C-fos和C-jun mRNA水平，继而前胶原酶mRNA逐步增加。此研究也说明在肝纤维化形成的不同阶段，基因表达不同，在诊断与治疗时应考虑不同。
1700630076
1700630077
（2）MMPs活性调节：MMPs酶原的活化细胞分泌无活性MMPs, 通过激活因子作用后，切除胶原酶的前端（即两个单体，10kD）约为80个氨基酸，形成具有活性的酶。现认为主要活化系统是纤溶酶活化系统。纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，由纤溶酶原经尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator, uPA）或组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA）催化生成。纤溶酶可部分活化MMP-1和MMP-3，进而导致MMPs的完全活化和超活化。
1700630078
1700630079
抑制MMPs活性的因素：①TIMPs是一类重要的调节细胞外MMPs活性的酶家族，目前已知四种TIMP-1～4，分子量在20～29kD之间，在肝脏中仅发现有TIMP-1和TIMP-2表达。TIMPs可由多种结缔组织产生，在肝脏由KC、HSC及MFB产生，以活化的HSC细胞表达最强，常与MMPs协同分泌，在一定程度上介导MMPs活性的自身调节。TIMPs与等比例的MMPs以非共价键可逆性结合而抑制MMPs活性。TIMP有N末端和C末端基本结构。C末端与MMPs结合，N末端介导对活化MMPs活性的抑制。TIMPs分子内含有大量的二硫键，Cys1和Cys70间的二硫键是抑制MMPs活性的决定性基团。近来研究表明，TIMP既可抑制MMPs活性，也可保持MMPs的稳定性，防止其酶原活化。Bahr等（1999年）研究认为AP-1 DNA结合蛋白具有调节活性HSC中控制TIMP-1的启动子作用。②α巨球蛋白可抑制MMPs的活性。α2巨球蛋白是一个高分子量（725kD）的血浆糖蛋白。可结合抑制间质胶原酶和基质分解素。③纤溶酶原激活抑制因子－1（PAI-1)，通过抑制uPA和tPA而抑制纤溶酶的生成，从而抑制MMPs的活化。④Banda等（2001年）在人肿瘤细胞的条件培养液里，找到一种分子量为16.5kD的MMPs抑制物。这种新的抑制物不是TIMP-1 TIMP-2、TIMP-3的片段。实验证实PCPE（前胶原C端蛋白酶增强物）的羧基片段可能就是这种新一类的MMPs的抑制物。
1700630080
1700630081
（三）ECM代谢的调节
1700630082
1700630083
1999年Gressner总结参与ECM调节的细胞因子即肽类物质有20余种，分别来自肝内细胞，包括HC、KC、SEC、外周单个核细胞（PBMC)、血小板、成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞等。单纯研究体内某一个细胞因子的功能，同时又排除其他因素干扰时，基因敲除（gene knock-out）技术或转基因（transgenic）技术是比较理想的方法。基因敲除技术原理是利用受体细胞基因组内同源序列间发生同源重组的原理，将敲除某一靶基因的载体导入受精卵或胚胎干细胞（ES）后通过同源重组使染色体上的目的基因失活，最终获得不表达目的基因的动物。转基因技术是通过分子克隆的方法将带有目的基因的表达载体直接导入动物受精卵或导入体外培养的ES中，ES细胞注入受精卵发育为四细胞或八细胞囊胚后植入假孕鼠内，最终发育形成的子代个体中的部分细胞将携带有已经整合入染色体的目的基因，再通过近交繁殖，获得纯系转基因动物。转基因可以使某一基因过量表达，从而观察其生物效应。从本质上讲，转基因是基因敲除的逆过程。D’sonza等（1998年）发现敲除了TGF-β1基因的幼鼠因无法控制的感染而死亡，成年鼠则形成播散性炎症，说明TGF-β1具有明显的抗炎作用。Kanzler等（1999年）将TGF-β1基因转入小鼠体内，使其过度表达，结果发现给转基因小鼠皮下注入脂多糖100mg15h后，转基因小鼠血浆TGF-β1可高达600ng/ml, 是正常小鼠血浆TGF-β1水平的100倍，表达高峰期15h后，肝内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA水平显著上升。此与Hellerbrand等（1999年）研究结果一致，后者将大鼠TGF-β1基因敲除，再以CCL4诱导肝纤维化形成，发现TGF-β1基因敲除的大鼠Ⅰ型胶原增加很少，仅为模型组的20％，而将TGF-β1基因敲除后的大鼠给予TGF-β2或TGF-β3转基因治疗，发现Ⅰ型胶原的合成抑制作用不能被TGF-β2或TGF-β3替代。从而得出结论在TGF-β1肝纤维化形成中起重要作用。TGF-β1在肝纤维化形成过程中参与信号传导。Munger等（2000年）发现，TGF-β1分泌后被封闭在前多肽内处于潜伏状态。这种潜伏状态叫做潜伏状态伴随多肽（latenly-associated peptide, LAP)，潜伏状态的TGF-β1在信号传导前必须在细胞外活化。另有人认为，TGF-β诱导基质产生的机制是即通过上调有关产生基质的基因转录，也通过下调有关降解基质的基因的表达。这些活性由细胞内的信号蛋白Smad家族介导。Smad家族是1995年和1996年分别在果蝇和线虫体内发现的，Smad的命名是由果蝇的Mad基因和线虫的Sma基因组合而成。Smad家族是TGF-βⅠ型受体目前已知的唯一底物。TGF-β与细胞表面TGF-βⅡ型受体结合，进而结合TGF-βⅠ型受体，使得I型受体激酶活化，随后Smad2和Smad3的磷酸化（TGF-β受体与Smad蛋白家族结合，使Smad蛋白家族在胞浆内磷酸化）。磷酸化的Smad蛋白再与公共介导物Smad4结合形成复合物，转入细胞核，调节TGF-β应答基因的转录。Tahashi等（2002年）研究认为，在培养的肌成纤维样细胞上TGF-β受体活化并诱导Smad2磷酸化，这一信号传导过程可被Smad7抑制。Schnable等（2001年）指出TGF-β在诱导肝纤维化发生的信号传导过程中，可以是Smad3依赖性的也可以是Smad3非依赖性的。近有报道减少Smad蛋白的表达，可减少TGF-β1介导肝硬化肝细胞生长抑制。多种因子对HSC均有作用，近来发现肝癌细胞亦能分泌致HSC活化因子，使之分泌胶原，在肝癌的癌块周围常有纤维包绕，此可防止癌细胞扩散。
1700630084
1700630085
2008年第163届Falk论坛，Friedman专题报告中，指出HSC的活化是肝纤维化发生发展的中心环节。对这过程分子机制的认识已取得很大进展，主要有：①阐明了关键的细胞因子对HSC和其信号传导通路的影响；②认识了HSC活化的调节；③基质蛋白酶（MMPS）及其抑制剂的特征；③证明凋亡（活化HSC）在肝纤维化消退的重要性并认识到其调节介质；④认识了HSC和ECM之间的复杂性及其动力学相互作用；⑤了解了其他细胞组分在肝纤维化中的作用及其与HSC的相互作用。此外，临床研究已经开始探索宿主的遗传多态性，以便预测肝纤维化的进展的危险性。
1700630086
1700630087
1．HSC的活化
1700630088
1700630089
多种因子（细胞与非细胞）、氧化应激（活性氧-ROS）及ECM的改变等外部因素，通过TGFβ/Smad, NF-κB、PPAR、MAKP、P13K、JAK/STAT等使转导通路活化HSC, 促进活化的有TGF-β、TGF-α、IL-1、IL-4、胰岛素样生长因子、IL-6、PDGF、单核细胞趋化因子、成纤维细胞生长因子、凝血酶、血管内皮生长因子、内皮素-1、去甲基肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、CTGF、血小板反应蛋白、瘦素、激活素A。认为主要为TGF-β1、PDGF、单核细胞趋化因子、胰岛素样生长因子、IL-6等，肝细胞生长因子列入可能是促肝纤维化因子。有报道HCV的核心蛋白与HBXAg也有直接激活HSC的作用。
1700630090
1700630091
2．HSC与其他细胞有关系
1700630092
1700630093
前述HSC及活化HSC的多源性，活化的NK细胞可杀伤活化的HSC, 活化HSC可抑制T细胞的活化，从而调节免疫。目前人们十分重视与脂肪细胞的关系。HSC与脂肪细胞相似性，如贮存脂肪，对脂肪介质反应及被相似的信号分子——过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）调节，PPARγ在维持HSC静状态的表型具有重要作用，其减少有助于HSC的活化。PPARγ属配体激活的核因子，因此PPARγ配体有望成为抗肝纤维化新一类药物。脂肪有益于HSC, 但有害于肝细胞。活化HSC有一定的胰岛素抵抗。
1700630094
1700630095
3．凋亡与HSC的关系
1700630096
1700630097
凋亡与肝纤维化关系密切。Canbay等（2004）总结肝细胞凋亡与炎症、肝纤维化关系时，指出肝细胞的凋亡能诱导HSC的活化，抑制肝细胞凋亡的一个小分子半胱氨酸——天门冬氨酸蛋白酶抑制剂近已发展为临床试用；还可以通过RNA干扰技术（iRNA）阻止肝细胞凋亡而达抗肝纤维化治疗目的。现认为抗肝纤维化治疗应更多考虑能促进和加速活化HSC的凋亡，较抑制HSC的活化更为重要。动物试验发现一个真菌代谢物可通过加速活化HSC的凋亡，减轻肝纤维化的程度，而对肝细胞与静止HSC的凋亡均无影响。近认为HSC是肝脏炎症后的效应细胞，不直接参与炎症，肝脏炎症反应重要的细胞内介质NF-κB，有促肝细胞凋亡，抗HSC凋亡，通过下调NF-κB活性，可发挥抗肝纤维化作用。因此认为NF-κB是一个切合实际的治疗肝纤维化的靶标。
1700630098
1700630099
4．与肝纤维化发生发展有关的基因（候选基因）
1700630100
1700630101
Bataller等（2003年）总结了在动物实验和人类有关肝脏疾病中与肝纤维化发生发展有关基因。其中在动物实验中确定的候选基因见表3-3。影响人体肝纤维化进展的候选基因有17种，主要是在酒精性肝病方面，但研究中存在着诸多不足：①样本过小；②病人来源于三级医院，病情往往较为严重；③研究中采用的分子生物学技术缺乏标准化；④属于单基因研究；⑤未对基因和环境的相互作用进行观察；⑥对等位基因研究，尚未明确基因功能意义。肝纤维化是一种多基因调控失调病。Bataller等（2003）总结通过基因修饰法进行肝纤维化动物实验，显示候选基因至少有14种。人类肝纤维化研究，相关基因有17种，并指出目下研究中存在较多方法学的问题。Friedman（2003）认为宿主的基因表型是肝纤维化进展的内源性决定因素，更多的与特异的基因和单个核苷酸多态性的联系，很可能在以后5～10年内明确。近对HCV感染者全基因组扫描分析，从1500例中明确了400多个单核苷酸多态性，其中7个与肝纤维化进展有关。基因治疗的研究从单基因进入多基因方面考虑。Magness等（2004）用α-SMA与Ⅰ型胶原双基因转入原代培养HSC和小鼠，可提供更多的表示纤维产生细胞株的特征和评价抗肝纤维化药物的有用工具。
1700630102
1700630103
表3-3 啮齿类动物模型中确定的候选基因（Bataller等 2003)
1700630104
1700630105
1700630106
1700630107
1700630108
不同病因慢性肝病肝纤维化发生的相关因素不完全相同。Bataller和Brenner（2005）总结慢丙肝与酒精性肝病肝纤维化进展相关基因完全不同，另尚有非基因因素参与。提示在研究与选择治疗时也应考虑；通过免疫调节者抗肝纤维化。2006年美国肝病年会，Muhanna等报道经小iRNA（siRNA）作用活化NK细胞杀伤活化HSC已获可喜的苗头。已有较多的报道T、B细胞、NK细胞与HSC的关系。免疫调节的抗肝纤维化作用值得重视。近年认为幼稚T细胞通过肝窦有孔的窦内皮细胞与肝细胞接触而活化，HSC有免疫负调节作用。关于肝纤维化发生机理研究诸多进展提示，肝纤维化治疗应全面考虑，既要针对致纤维化主要因子，又要不影响对人体重要生理功能。
1700630109