1700630110
四、肝纤维化的基因诊断
1700630111
1700630112
（一）由遗传病引起的肝纤维化的诊断
1700630113
1700630114
因染色体变异、单基因遗传病和多基因遗传病所致的肝纤维化诊断，从理论上讲均可发现变异的基因，有关方面正处于研究中。例如先天性肝纤维化是因先天性染色劣性遗传所致的肝脏结缔组织增生，但肝实质细胞一般正常。原发性胆汁性肝硬化是由MHC编码遗传易感性免疫介导所致的慢性胆汁淤滞。特发性血色病是一种常染色体隐性遗传性代谢障碍或代谢缺陷性疾病，以铁离子代谢紊乱为特征。肝豆状核变性（Wilson病）是好发于青少年的常染色体隐性遗传病，主要是铜代谢异常而引起肝脏和锥体外神经综合征，用RFLP连锁分析，证实P68RS2.0标记可用于本病的症状前诊断。Alain等（1996年）对巴西人群中曼氏血吸虫高感染率产生原因分析后认为：高感染率的产生在很大程度上取决于患者染色体5q31－33区的基因。其后（2001年）对苏丹人群中血吸虫感染者进行分析后认为：感染者是否会发生严重的肝纤维化取决于一个主要的基因位点，该位点与IFN-γR1基因紧密连锁。该位点基因与5q31－33区的基因之间的关系尚不清楚。McManus等（2001年）对中国血吸虫感染者的HLAⅡ类抗原进行分析后发现：HLA-DRB1的等位基因为0901或1302者、HLA-DQB1的等位基因为0303或0609者易发展为肝纤维化。而HLA-DQB1的等位基因为1501或0601者即使感染了血吸虫，肝脏和脾脏也不会受累。另外还指出，当患者HLA-DQB1的等位基因位点为0601时，即使同时有HLA-DRB1*0901、HLA-DQB1*0303，也不易发展为肝纤维化。
1700630115
1700630116
（二）测定mRNA水平
1700630117
1700630118
1．测定肝组织中ECM、细胞因子、MMPs与TIMPs的mRNA水平有助于对肝纤维化机理的研究及对其诊断、治疗及预后的判定。
1700630119
1700630120
2．测定患者外周血单个核细胞（PBMC）内的细胞因子、MMPs与TIMPs的mRNA水平，有助于对肝纤维化发生和发展的预测及肝纤维化的诊断。PBMC中的TGFβ1mRNA与肝组织中差异无显著性，并发现肝纤维化患者PBMC中TGFβ1和IFNγmRNA的含量比值可能有较大的临床意义。笔者等（2003年）对慢性乙型肝炎引起的肝纤维化患者诊断指标的研究中发现，筛选肝纤维化病人时，以血清PDGF-BB、PBMC中TIMP-1mRNA、TIMP-1mRNA/MMP-1mRNA联合最佳，同一项指标的诊断价值如TIMP-1的血清浓度优于其mRNA水平（见表3-4）。多种因素可以影响肝纤维化指标水平，因此，对于肝纤维化指标异常者应综合分析。前已述测患者PBMC中的SNP, 预测肝纤维化的进展可能有实用价值。肝纤维化是一个伴有千个基因及其编码蛋白变化的复杂疾病，高通量分析方法如基因表达芯片，质谱技术和反向蛋白质组学等正在应用于该病的研究。研究较多的丙型肝炎肝纤维化的研究，发现2个基因的变化与慢丙肝发展为进展性肝纤维化有关。近有报道对慢丙肝患者发展为肝硬化的危险因素分析，发现7个指标（基因）有关。目前已建立了小鼠肝脏基因表达网络的基因调节的基因组学水平分析，数量性状基因座（quantitative trait loci, QTLs）图可供比较使用（www.genenetwork.org)。郑敏等成功地构建了日本血吸虫病肝纤维化小鼠与正常小鼠HSC差异表达的消减cDNA文库，还发现有特异性蛋白分子YKL-40（人体软骨糖蛋白－39）有助于诊断，测定血吸虫病肝纤维化者血清YKL-40与透明质酸（HA）比较，结果显示其反映肝纤维化程度，优于目前认为最敏感的肝纤维化指标HA。近有报道小鼠肝脏与血浆全面的定量蛋白组学分布图，此有助研究各种肝病的发现机理、诊断、治疗和预防。
1700630121
1700630122
表3-4 对9个指标进行ROC分析
1700630123
1700630124
1700630125
1700630126
1700630127
（三）测量血清（浆）相关基因产物
1700630128
1700630129
过去研究较多的测定血清ECM成分的变化例如HA、PⅢP/PCⅢ、Ⅳ-C、LN称4项指标，国内外有根据多种相关指标，组合联合检测，通过数学演算从而建立数学诊断模型，已有10余种之多，2008年有两篇报道：分别为欧洲推荐的HA、PⅢP、TIMP-1和美国推荐的HA、TIMP-1、血小板计数。
1700630130
1700630131
Lai等报道了小鼠肝脏与血浆的蛋白组学研究结果、获得全面的和定量的蛋白组学分布图，存在肝脏内的大都能在血浆内检测到，有助于更好地了解肝脏疾病的发病机制、诊断、治疗与预防。Morra等用表面增强激光解析电离蛋白质芯片飞行时间质谱（SELDITOF）法血清蛋白谱和已有肝纤维化检测指标在诊断慢丙肝活动中肝纤维化的比较，前者优于后者，但由于费用高昂、变化多等原因还是影响其在临床应用。目前还在寻找新的诊断方法，强调测定低浓度的血清蛋白的测定。必定要与老的方法比较。N-糖组分析是目下值得关注的，具有应用前景的用于辅助肝病诊断的重要手段。
1700630132
1700630133
五、基因治疗
1700630134
1700630135
表3-3提及有关抑制肝纤维化的基因已有用于抗肝纤维化的基因治疗动物实验研究。已有报道导入MMP-1、反义TIMP基因有一定的抗肝纤维化的作用，还有报道反义寡核苷酸（ASO）DNA, 能抑制Ⅰ型胶原mRNA的表达。IFN-γ基因的转入与TGFβ1基因的敲除对肝纤维化均有抑制作用。Rudolph等（2000年）报道端粒酶基因治疗端粒酶缺失的实验性肝硬化小鼠获较好效果，引人注目。期望在短期内通过动物实验从体外到体内进行大量研究仍属必要，进入临床试验恐非短期内能达到目的。基因治疗是正在快速发展成为极有前途的治疗人类疾病的方法。
1700630136
1700630137
治疗肝纤维化已有较多的研究包括祛除病因、抗HBV基因治疗和抗肝纤维化治疗。前者另有专门介绍，本章从略，现仅介绍后者。人们更为重视的利用分子生物技术，发现有效的靶向抗肝纤维化治疗方法（药物），目下列为靶标的有抗肾素—血管紧张素系列（RAS)、GTGT拮抗选择性抑制Smad3小分子，下调NK-κB及PPARγ（激动剂），以及新近研究的大麻素受体1（CB1)、骨形态发生蛋白7（BMP-7）神经营养素受体（neurotrophin receptor P75NTR）等，这方面已有较多报道，本章仅作简介。
1700630138
1700630139
（一）抑制HSC活化
1700630140
1700630141
抑制HSC活化，减少ECM生成，包括TβRⅠ和TβRⅡ反义核糖核酸PDGF受体或PDGFβ反义互补DNA、瘦素、SiRNACB1、BMP-7、P75NTR, 后3者最引人注目。
1700630142
1700630143
1．CB1
1700630144
1700630145
CB1拮抗剂体是治疗肝纤维化新的方法，CB1受体阻滞剂可以降低肝脏对急性损伤的修复反应，抑制肝纤维化的发生发展，敲除CB1基因小鼠TGFβ1表达减少，HSC活化抑制，胆汁性肝硬化肝组织中CB1受体表达较正常者增加，日本血吸虫病肝纤维化小鼠约增加2倍，并与门脉高压发生有关。其机制被认为是通过HSC的活化与肝内免疫调节，还有被认为是通过活化Th1细胞促进IFN-γ分泌，提高血清脂联素水平，降低胰岛素抵抗及促进MFB凋亡，从而达到溶解ECM的作用。2006年6月欧洲市场上已有供应其阻滞剂rimonabant（SR141716A)。近获悉正在开始多中心、大样本的临床研究。
1700630146
1700630147
2．BMP-7
1700630148
1700630149
Kinoshita等（2007）在整体水平与细胞水平证实腺病毒介导BMP-7在HSC内表达可抑制Ⅰ型胶原和α-SMA的合成。BMP-7维持肝脏健康，促进肝脏再生，具有抗炎与抗肝纤维作用。BMP-1于1990年被克隆，是TGFβ的亚（家）族，具有刺激成骨作用。最初是在作用一种可在异位诱导骨和软骨形成的蛋白中被发现。从牛生骨蛋白质中提取，是经胰蛋白酶作用产生的肽类。Sungimoto等研究认为BMP-7是一种新的促肝脏再生的激素，BMP-7是有关肝脏发生与发育的关键蛋白，血循环浓度100～300μg/ml，正常肝脏不表达BMP-7，但受体存在成熟肝细胞上，可能具有内源性调节肝细胞增殖和肝脏内环境稳定作用。肝脏部分切除，BMP-7促进肝脏再生，给予重组人BMP-7后显著增强肝脏再生及促进肝脏功能；还证明肾与骨产生的BMP-7内源性的肝细胞健康的调节者。肝病专家评论指出，BMP-7与TGFβ是两者相互拮抗的细胞因子，作用于不同的细胞表面受体。细胞内信号传导通过Smads系统，BMP抑制EMT, 提示BMP-7是一个有前途的治疗肝纤维化的靶点。有认为BMP-7还有抗凋亡和抗炎症作用，TGFβ1/BMP-7比值是估价肝纤维化进展速度及判断预后的有用指标。BMP-7是一个老药，FDA在2004年批准基因工程产品，OP-1PUTTY用于临床脊柱融合手术。BMP-7已进入临床应用。2007年某杂志误译为骨髓蛋白7。
1700630150
1700630151
3．P75NTR
1700630152
1700630153
2007年《Science》发表了Passino等“神经营养素P75NTR调节肝星状分化”的论文。P75NTR是TNF受体亚族，在肝纤维化和肝硬化的肝脏损伤后HSC内表达，是肝脏修复的调节者。在小鼠体内P75NTR耗竭时，加重肝脏的病理和抑制肝细胞的增生。P75NTR-/-的HSC不能分化到MFB; 不能维持肝细胞增殖，P75NTR的信号的抑制可减少GTP酶Rho导致的损伤HSC的分化，此研究证实患病的肝脏中，P75NTR可调节HSC分化和维持肝细胞再生。肝病专家以“简单的真理是很少正确的，真理从不简单：P75NTR对HSC的分化与死亡的双重作用”为题做评论并综述这方面的研究进展，提出人们将揭示在肝脏中使人有极大吸引力的一个调节网络，应进一步研究。
1700630154
1700630155
（二）促进HSC凋亡，抑制肝细胞凋亡
1700630156
1700630157
活化的HSC是ECM的主要来源，促其凋亡可促使纤维化的消退，而在肝细胞则相反，肝受损后肝细胞凋亡后，可诱导HSC的活化。现已研究发现IFN-γ与扶正化瘀胶囊均有抑制肝细胞凋亡和促进活化HSC的凋亡的作用。在细胞凋亡的调节中，Fas-FasL系统是凋亡调节过程中的重要因素，研究发现可溶性FasL诱导的HSC凋亡是一种蛋白和RNA合成依赖过程，如果用环酰胺阻断蛋白人工合成或用放线菌素D阻断RNA的合成，可溶性FasL诱导的HSC凋亡即受抑制。采用多霉黏素（gliotoxin)——真菌抗代谢药物，在动物体内可选择地诱导HSC凋亡，减轻肝纤维化。Zou等（2007年）发现合成YLGA肽，通过中止蛋氨酸作用，抑制肝细胞凋亡和肝损伤而达到治疗脂肪性肝炎肝纤维化的目的。
1700630158
1700630159
（三）促ECM降解