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（二）测定mRNA水平
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1．测定肝组织中ECM、细胞因子、MMPs与TIMPs的mRNA水平有助于对肝纤维化机理的研究及对其诊断、治疗及预后的判定。
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2．测定患者外周血单个核细胞（PBMC）内的细胞因子、MMPs与TIMPs的mRNA水平，有助于对肝纤维化发生和发展的预测及肝纤维化的诊断。PBMC中的TGFβ1mRNA与肝组织中差异无显著性，并发现肝纤维化患者PBMC中TGFβ1和IFNγmRNA的含量比值可能有较大的临床意义。笔者等（2003年）对慢性乙型肝炎引起的肝纤维化患者诊断指标的研究中发现，筛选肝纤维化病人时，以血清PDGF-BB、PBMC中TIMP-1mRNA、TIMP-1mRNA/MMP-1mRNA联合最佳，同一项指标的诊断价值如TIMP-1的血清浓度优于其mRNA水平（见表3-4）。多种因素可以影响肝纤维化指标水平，因此，对于肝纤维化指标异常者应综合分析。前已述测患者PBMC中的SNP, 预测肝纤维化的进展可能有实用价值。肝纤维化是一个伴有千个基因及其编码蛋白变化的复杂疾病，高通量分析方法如基因表达芯片，质谱技术和反向蛋白质组学等正在应用于该病的研究。研究较多的丙型肝炎肝纤维化的研究，发现2个基因的变化与慢丙肝发展为进展性肝纤维化有关。近有报道对慢丙肝患者发展为肝硬化的危险因素分析，发现7个指标（基因）有关。目前已建立了小鼠肝脏基因表达网络的基因调节的基因组学水平分析，数量性状基因座（quantitative trait loci, QTLs）图可供比较使用（www.genenetwork.org)。郑敏等成功地构建了日本血吸虫病肝纤维化小鼠与正常小鼠HSC差异表达的消减cDNA文库，还发现有特异性蛋白分子YKL-40（人体软骨糖蛋白－39）有助于诊断，测定血吸虫病肝纤维化者血清YKL-40与透明质酸（HA）比较，结果显示其反映肝纤维化程度，优于目前认为最敏感的肝纤维化指标HA。近有报道小鼠肝脏与血浆全面的定量蛋白组学分布图，此有助研究各种肝病的发现机理、诊断、治疗和预防。
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表3-4 对9个指标进行ROC分析
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（三）测量血清（浆）相关基因产物
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过去研究较多的测定血清ECM成分的变化例如HA、PⅢP/PCⅢ、Ⅳ-C、LN称4项指标，国内外有根据多种相关指标，组合联合检测，通过数学演算从而建立数学诊断模型，已有10余种之多，2008年有两篇报道：分别为欧洲推荐的HA、PⅢP、TIMP-1和美国推荐的HA、TIMP-1、血小板计数。
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Lai等报道了小鼠肝脏与血浆的蛋白组学研究结果、获得全面的和定量的蛋白组学分布图，存在肝脏内的大都能在血浆内检测到，有助于更好地了解肝脏疾病的发病机制、诊断、治疗与预防。Morra等用表面增强激光解析电离蛋白质芯片飞行时间质谱（SELDITOF）法血清蛋白谱和已有肝纤维化检测指标在诊断慢丙肝活动中肝纤维化的比较，前者优于后者，但由于费用高昂、变化多等原因还是影响其在临床应用。目前还在寻找新的诊断方法，强调测定低浓度的血清蛋白的测定。必定要与老的方法比较。N-糖组分析是目下值得关注的，具有应用前景的用于辅助肝病诊断的重要手段。
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五、基因治疗
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表3-3提及有关抑制肝纤维化的基因已有用于抗肝纤维化的基因治疗动物实验研究。已有报道导入MMP-1、反义TIMP基因有一定的抗肝纤维化的作用，还有报道反义寡核苷酸（ASO）DNA, 能抑制Ⅰ型胶原mRNA的表达。IFN-γ基因的转入与TGFβ1基因的敲除对肝纤维化均有抑制作用。Rudolph等（2000年）报道端粒酶基因治疗端粒酶缺失的实验性肝硬化小鼠获较好效果，引人注目。期望在短期内通过动物实验从体外到体内进行大量研究仍属必要，进入临床试验恐非短期内能达到目的。基因治疗是正在快速发展成为极有前途的治疗人类疾病的方法。
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治疗肝纤维化已有较多的研究包括祛除病因、抗HBV基因治疗和抗肝纤维化治疗。前者另有专门介绍，本章从略，现仅介绍后者。人们更为重视的利用分子生物技术，发现有效的靶向抗肝纤维化治疗方法（药物），目下列为靶标的有抗肾素—血管紧张素系列（RAS)、GTGT拮抗选择性抑制Smad3小分子，下调NK-κB及PPARγ（激动剂），以及新近研究的大麻素受体1（CB1)、骨形态发生蛋白7（BMP-7）神经营养素受体（neurotrophin receptor P75NTR）等，这方面已有较多报道，本章仅作简介。
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（一）抑制HSC活化
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抑制HSC活化，减少ECM生成，包括TβRⅠ和TβRⅡ反义核糖核酸PDGF受体或PDGFβ反义互补DNA、瘦素、SiRNACB1、BMP-7、P75NTR, 后3者最引人注目。
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1．CB1
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CB1拮抗剂体是治疗肝纤维化新的方法，CB1受体阻滞剂可以降低肝脏对急性损伤的修复反应，抑制肝纤维化的发生发展，敲除CB1基因小鼠TGFβ1表达减少，HSC活化抑制，胆汁性肝硬化肝组织中CB1受体表达较正常者增加，日本血吸虫病肝纤维化小鼠约增加2倍，并与门脉高压发生有关。其机制被认为是通过HSC的活化与肝内免疫调节，还有被认为是通过活化Th1细胞促进IFN-γ分泌，提高血清脂联素水平，降低胰岛素抵抗及促进MFB凋亡，从而达到溶解ECM的作用。2006年6月欧洲市场上已有供应其阻滞剂rimonabant（SR141716A)。近获悉正在开始多中心、大样本的临床研究。
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2．BMP-7
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Kinoshita等（2007）在整体水平与细胞水平证实腺病毒介导BMP-7在HSC内表达可抑制Ⅰ型胶原和α-SMA的合成。BMP-7维持肝脏健康，促进肝脏再生，具有抗炎与抗肝纤维作用。BMP-1于1990年被克隆，是TGFβ的亚（家）族，具有刺激成骨作用。最初是在作用一种可在异位诱导骨和软骨形成的蛋白中被发现。从牛生骨蛋白质中提取，是经胰蛋白酶作用产生的肽类。Sungimoto等研究认为BMP-7是一种新的促肝脏再生的激素，BMP-7是有关肝脏发生与发育的关键蛋白，血循环浓度100～300μg/ml，正常肝脏不表达BMP-7，但受体存在成熟肝细胞上，可能具有内源性调节肝细胞增殖和肝脏内环境稳定作用。肝脏部分切除，BMP-7促进肝脏再生，给予重组人BMP-7后显著增强肝脏再生及促进肝脏功能；还证明肾与骨产生的BMP-7内源性的肝细胞健康的调节者。肝病专家评论指出，BMP-7与TGFβ是两者相互拮抗的细胞因子，作用于不同的细胞表面受体。细胞内信号传导通过Smads系统，BMP抑制EMT, 提示BMP-7是一个有前途的治疗肝纤维化的靶点。有认为BMP-7还有抗凋亡和抗炎症作用，TGFβ1/BMP-7比值是估价肝纤维化进展速度及判断预后的有用指标。BMP-7是一个老药，FDA在2004年批准基因工程产品，OP-1PUTTY用于临床脊柱融合手术。BMP-7已进入临床应用。2007年某杂志误译为骨髓蛋白7。
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3．P75NTR
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2007年《Science》发表了Passino等“神经营养素P75NTR调节肝星状分化”的论文。P75NTR是TNF受体亚族，在肝纤维化和肝硬化的肝脏损伤后HSC内表达，是肝脏修复的调节者。在小鼠体内P75NTR耗竭时，加重肝脏的病理和抑制肝细胞的增生。P75NTR-/-的HSC不能分化到MFB; 不能维持肝细胞增殖，P75NTR的信号的抑制可减少GTP酶Rho导致的损伤HSC的分化，此研究证实患病的肝脏中，P75NTR可调节HSC分化和维持肝细胞再生。肝病专家以“简单的真理是很少正确的，真理从不简单：P75NTR对HSC的分化与死亡的双重作用”为题做评论并综述这方面的研究进展，提出人们将揭示在肝脏中使人有极大吸引力的一个调节网络，应进一步研究。
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（二）促进HSC凋亡，抑制肝细胞凋亡
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活化的HSC是ECM的主要来源，促其凋亡可促使纤维化的消退，而在肝细胞则相反，肝受损后肝细胞凋亡后，可诱导HSC的活化。现已研究发现IFN-γ与扶正化瘀胶囊均有抑制肝细胞凋亡和促进活化HSC的凋亡的作用。在细胞凋亡的调节中，Fas-FasL系统是凋亡调节过程中的重要因素，研究发现可溶性FasL诱导的HSC凋亡是一种蛋白和RNA合成依赖过程，如果用环酰胺阻断蛋白人工合成或用放线菌素D阻断RNA的合成，可溶性FasL诱导的HSC凋亡即受抑制。采用多霉黏素（gliotoxin)——真菌抗代谢药物，在动物体内可选择地诱导HSC凋亡，减轻肝纤维化。Zou等（2007年）发现合成YLGA肽，通过中止蛋氨酸作用，抑制肝细胞凋亡和肝损伤而达到治疗脂肪性肝炎肝纤维化的目的。
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（三）促ECM降解
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主要是导入MMPS和其活性调节因子的表达，抑制TIMPs的表达。Roderfeld等（2006）将MMP-9突变体插入腺病毒载体，在CCl4诱导大鼠肝纤维化模型中，能捕获TIMP-1减少血管压及周围的胶原沉积，肝脏羟脯氧酸含量及肝纤维化标志物mRNA都显著降低，在体内外研究均显示MMP-9突变体均能抑制HSC活化，促其凋亡。Hu等采用靶向TIMP2的SiRNA治疗CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，能抑制HSC活化促进ECM降解和促进肝细胞再生。
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（四）其他方面
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肝细胞生长因子与表皮生长因子均能诱导肝细胞增殖，促进肝细胞再生可能成为肝纤维化基因治疗的一种手段，但对前者诱导肝细胞癌生长有不同看法。另外IL-10、IFN-γ及α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）均能抑制肝纤维化，而单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）可刺激纤维化发生，这些可通过诱节细胞因子抑制间质炎症反应也是肝纤维化基因治疗的重要策略。特别是MSH是一种神经内分泌激素，近发现α-MSH对动物生理活动发挥广泛的调节作用。包括对成纤维细胞。Wang等（2006年）用电穿孔方法诱导α-MSH表达质粒导入硫代乙酰胺大鼠肝细胞化模型，能降低TGFβ1、Ⅰ型胶原及细胞黏附分子的mRNA水平，减少α-SMA和环氧合酶-2的表达。增强MMP活性，使TIMPs失活，α-MSS能逆转肝纤维化。