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1700635721 (2)过度激活:在病理形态学方面,对动物注射LPS后,发现渗出的巨噬细胞分布于肝小叶,且分布与肝细胞坏死区域相一致。与库普弗细胞相比,此类巨噬细胞更大,伪足伸出更明显,高度空泡化,浆核比例增大,受LPS刺激后的库普弗细胞和巨噬细胞(尤其是新的巨噬细胞)在吞噬、化学趋化、细胞毒及代谢等功能方面均明显增强,并可释放大量中间介质,如TNF、IL-l、IL-6、LTs和PAF、一氧化氮(NO)、超氧化物阴离子、过氧化氢等,还有各种蛋白酶等,目前认为,上述毒性分泌产物是肝损害的重要原因。
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1700635723 PAF主要由库普弗细胞及血管内皮细胞合成。有报道,以丙酸菌加LPS可致小鼠急性肝坏死,同时给予PAF拮抗剂预处理,则可抑制腹水形成。Kitagawa等的研究发现静注PAF后血压及门静脉压迅速下降,然后逐渐回升;门静脉注射PAF后血压稍降低,但注射后4min PVP一过性升高,门静脉注射LPS后8~20min, 也见PVP升高,第12min血压轻度降低,PAF的拮抗剂CV-6209可显著减轻LPS所致PVP升高及血压降低,提示PAF是LPS所致门静脉高压的重要原因。已知PAF可广泛结合于门静脉周围的微血管系统,库普弗细胞具有PAF的特异性受体,结合后可致花生四烯酸释放及花生四烯酸生成,这两点可能是PAF导致门静脉压增高的原因。
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1700635725 关于NO及其代谢产物在机体对LPS的反应中的作用,主要发现是,在肝细胞—库普弗细胞混合培养时加入LPS, 可生成大量左旋精氨酸,在氧化酶作用下进一步转化为NO,NO的终产物是瓜氨酸及硝酸盐/亚硝酸盐(NO2-/NO3-),它们能抑制肝细胞线粒体呼吸,减少ATP生成,从而在转译后水平抑制蛋白质的合成。这种细胞功能的下调作用有助于细胞渡过低氧症等应激期。用NO生成抑制剂可抑制LPS诱发的N0代谢产物生成,同时加重肝损害程度。适量的NO对肝细胞的保护作用,是因为它能调节肝动脉及门静脉的灌流;抑制肝脏微循环的炎症;抑制活性氧中间产物的产生及TNFα引起的肝脏损伤;抑制低血流量下的血小板聚集,并与超氧化物结合,形成无毒代谢产物N03,避免细胞受损害。过量的刺激如LPS引起NO产生过量则可损伤肝脏。NO可直接或通过产生过氧化亚硝酸盐(peroxynitrite)损伤肝脏。研究还发现,由LPS导致NO过量产生引起的肝损伤与iNOS、TN Fα、IL-6的mRNA转录持续上调有关。
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1700635727 此外,还有有关其他介质如前列腺素、血栓素及LTs等作用的研究报道。
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1700635729 2.肝窦内皮细胞及其介质
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1700635731 最近研究表明,肝窦内皮细胞在LPS所致肝损害中也有重要作用,给大鼠LPS后,肝窦内皮细胞除数量增多外,其体积大,颗粒增多,并产生活性中间介质、IL-1和II-6。研究发现血管内皮细胞受巨噬细胞生成的细胞因子刺激后,可发生增殖并生成超氧化物阴离子、IL-l和IL-6等内皮细胞受炎症介质刺激,可释放花生酸、PAF反应性氮中间介质、纤维蛋白溶酶原活化因子及溶酶体等,它们又反过来调节微血管的生长和完整性。
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1700635733 关于库普弗细胞和肝窦内皮细胞的关系,Laskin提出,受毒性物质(包括LPS)刺激后先有库普弗细胞的活化,生成细胞因子等中间介质,后者作用于肝窦内皮细胞,进一步释放各种中间介质,引起一系列病理反应。
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1700635735 3.肿瘤坏死因子在内毒素所致肝损害中的作用
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1700635737 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α是具有广泛生物学活性的多肽介质,一方面参与机体的免疫防御机能,另一方面与介导炎症反应、组织损伤、休克等病理生理过程有关。近年研究表明,TNF介导了内毒素的许多生物学作用及病理生理过程,在内毒素所致肝损害过程中起重要的作用。
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1700635739 (1)TNF-α的一般生物学特性:TNF-α为17kD的多肽。人TNF-α由157个氨基酸残基组成,不含糖基,而鼠TNF-α为156个氨基酸残基,含有唾液酸或氨基半乳糖,人与鼠TNF-α的氨基酸顺序有78%的同源性,人TNF-α的基因位于第6染色体的主要组织相容复合体。TNF-α具有疏水性,等电点为4.7~5.3,对某些蛋白酶敏感。其活性形成55kD的三聚体。
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1700635741 巨噬细胞及单核细胞是产生TNF-α的主要细胞。淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞等受刺激也可合成少量TNF-α。肝库普弗细胞为体内最大的固定巨噬细胞池,是产生TNF-α的主要部位。库普弗细胞受内毒素刺激可显著增加TNF-α的释放。γ-干扰素可增强内毒素诱导的TNF-α的释放。前列腺素E2和地塞米松则抑制TNF-α产生。而TNF-α又可诱导库普弗细胞合成释放前列腺素E2形成反馈抑制,这对TNF-α合成具有重要的调控作用。内毒素是诱生TNF-α最强的刺激剂。内毒素可诱导巨噬细胞的TNF-α基因转录迅速增加,致使细胞内相应的mRNA含量和TNF-α的释放显著增加。给人或哺乳动物注入小剂量内毒素后约30min, 血中即可检出TNF-α,在1~2h内,其TNF-α水平达到峰值。此后开始下降,约5h降至基线水平,TNF-α的半衰期约为5~10min。体内示踪实验表明,TNF-α主要分布于肝脏,其次为皮肤、胃肠道和肾,提示肝脏富含TNF-α受体。
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1700635743 TNF-TNFα可通过内分泌、旁内分泌(paracrine)和自分泌(autocrine)发挥生物学作用,但TNF-α介导的组织器官病理生理效应可能主要取决于特定组织的旁分泌和(或)自分泌作用。TNF-α的生物学效应是由细胞膜特异受体介导的,其信号的跨膜传递及效应机制尚未完全明了。
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1700635745 (2)TNF-α在内毒素所致肝损害中的作用:近年研究表明,内毒素除直接对肝细胞造成损害外,更主要的是通过激活库普弗细胞和肝内核细胞释放促炎介质,包括多肽介质(TNFα、IL-1、II-6)、脂类介质(白三烯、血栓素、PAF)和氧自由基等介导肝损害。内毒素可刺激库普弗细胞和浸润的单核细胞产生TNF-α受体,对TNF-α的毒性效应有高度的敏感性。TNF-α不仅能介导内毒素的多种生物学作用,而且通过诱生其他炎性介质协同作用,扩大其生物学效应,从不同环节对机体产生炎性反应和组织损伤。因此TNF被视为内毒素所致肝脏病理生理过程的关键性促炎介质。
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1700635747 Iehmann等在内毒素敏感小鼠C3H/TifF和内毒素耐受小鼠C3H/HeJ的实验中可观察到,给动物预先注入肝毒性剂氨基半乳糖(CaIN),随后输入重组TNF-α或内毒素,可使C3H/TifF小鼠表现出类似的致死效应,不能合成TNF-α的C3H/HeJ小鼠可耐受致死剂量的内毒素,但接受外源性TNF-α后则产生致死效应。在痤疮丙酸杆菌加内毒素引起的肝损害小鼠模型中,肝内单核巨噬细胞产生TNF-α明显增多,血清TNF-α水平显著升高并伴有肝细胞广泛性坏死,TNF-α代替内毒素也可诱发类似的肝细胞坏死。肝细胞生长因子可抑制诱生TNF-α,从而明显减轻GaLN加内毒素所致的肝细胞广泛性坏死,有实验表明内毒素血症诱导血中TNF-α水平升高,而TNF-α增加与肝组织损害程度和血清谷丙转氨酶(ALT)活性升高呈明显正相关,抗TNF-α抗体可显著减轻肝损害程度和降低血清ALT活性。上述结果强烈提示TNF-α在内毒素引起的肝损害过程中起介质作用。Hishinuma等的实验进一步证实TNF-α介导内毒素/GaLN所致的肝损害。作者给内毒素敏感的小鼠静脉注入内毒素(0.2μg/kg)加GaLN(800mg/kg)导致大片肝坏死且伴有血清转氨酶水平显著升高,重组TNF-α代替内毒素输入内毒素耐受小鼠C2H/HeJ可诱发类似的急性肝坏死和血清转氨酶升高。内毒素/GaLN和TNF-α/GaLN可诱发类似的急性肝坏死和血清转氨酶升高。内毒素/GaLN和TNF-α/GaLN诱导的肝损害在组织病理学上十分相似。
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1700635749 预先给予抗TNF抗体可防止内毒素引起的肝损害,其保护作用与抗TNF抗体有剂量依赖关系。
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1700635751 肝脏急性期反应与TNF-α生物作用发挥有密切关系。肝细胞产生的急性期反应蛋白对TNF-α有拮抗作用。GaLN抑制肝细胞的TNF合成,干扰细胞合成分泌急性期反应蛋白,因此GaLN与内毒素合用能显著增加肝细胞对TNF-α毒性的敏感性。有实验证明诱导内源性急性期反应蛋白增加可明显改善内毒素GaLN或TNF-α/GaLN引起的肝损害和致死反应。
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1700635753 肝库普弗细胞的功能状态在TNF-α介导内毒素所致肝损害中具有非常重要的意义。Hartung等应用肝细胞和肝非实质细胞(含3%库普弗细胞)混合培养,加入内毒素(10μg/ml)可诱导培养液中TNF-α浓度升高,产生肝细胞毒素反应。但抑制库普弗细胞功能则不能造成肝细胞毒性,用重组TNF-α代替内毒素加入上述混合培养中也不能引起肝细胞毒性反应。内毒素(3μg/ml)联合应用则要重建毒性效应,还进一步证实内毒素诱导的肝损害不但取决于库普弗细胞的功能状态,而且依赖于肝细胞对内毒素诱生的炎性介质的反应性。而TNF-α并非介导肝细胞损害的唯一介质,说明TNF-α是介导内毒素毒性反应的必要条件,但仍需要内毒素刺激库普弗细胞产生的其他炎性介质共同作用,介导肝损害的发生。
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1700635755 (3)TNF-α介导肝损害的机制:TNF-α介导肝损害的机制尚未阐明,现有资料提示与以下几方面有关:①介导脂类介质或其他多肽介质的产生。
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1700635757 TNF-α能诱导合成磷脂酶A2活化蛋白,并激发磷脂酶A2促进花生四烯酸代谢生成具有生物活性的脂类介质(PAF, LTS, TSA2, PCs)TNF-α刺激鼠巨噬细胞,中性粒细胞和血管内皮细胞合成和释放血小板活化因子(PAF)明显增多,给大鼠输入TNF-α后,肠组织PAF水平升高,伴有组织坏死,用PAF拮抗剂可减轻TNF-α引起的肠组织坏死。外源性输入TNF-α可导致动物体内产生白三烯(LTS)明显增多。而应用抗TNF抗体能有效防止TNF-α或内毒素诱生的白三烯。此外,TNF-α还诱生其他多肽介质(IL-1, IL-6)参与炎性反应和组织损伤。②诱导自由基的产生及脂质过氧化。TNF-α介导的细胞毒性作用与氧自由基的产生有关。TNF-α可诱导细胞线粒体的锰超氧物歧化酶(MnSOD)增加而表现出对TNF毒性作用的耐受性。MnSOD为自由基清除酶,间接表明TNF-α介导自由基的生成。进一步实验表明,重组TNF-α引起细胞内自由基产生,导致细胞膜脂质过氧化和杀细胞效应。③活化中性粒细胞和单核巨噬细胞。TNF-α可直接激活中性粒细胞,增强吞噬活性,释放溶酶体酶和“呼吸爆发”产生氧自由基;TNF-α还以自分泌方式活化单核巨噬细胞,促进其细胞毒性作用。体外实验表明TNF-α对血循环单核细胞有明显的趋化作用,并可诱导丝氨酸蛋白酶介导中性粒细胞向肝组织浸润并促进肝窦状隙内皮细胞的黏附作用。近年研究表明,TNFα通过一种不同于Fas系统的途径引起肝细胞凋亡,通常IL-1对TNFα有协同作用,随后TNFα、血小板活化因子又可激活中性粒细胞并趋化至垂死的肝细胞,最终引起肝脏的严重损伤。④对内皮细胞的作用。TNF-α可直接激活中性粒细胞黏附于肝窦状隙内皮细胞可能是内毒素引发肝脏炎性反应的早期细胞反应。TNF-α可诱导内皮细胞膜表面C3bi受体,白细胞黏附分子和释放PAF, 促使炎性细胞对内皮细胞的黏附及损伤。TNF-α还增强血管内皮细胞的促凝活性,诱发血管内凝血,影响肝脏微循环,促进了肝损害的发生和发展。
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1700635759 4.IL-18
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1700635761 IL-18是内毒素引起肝脏损伤重要介质。包括活化的巨噬细胞尤其是库普弗在内的很多种细胞可产生IL-18,IL-18可激活Th1细胞,引起炎症性组织损伤。由病毒引起的暴发性肝炎及原发性胆汁性肝硬化病人血清IL-18水平升高,并与疾病的严重程度有关。在肝硬化患者,外周血单个核细胞(PBMC)IL-18-mRNA增加,并与血液内毒素、CD14水平相关。IL-18结合蛋白(IL-18-binding protein, IL-18BP)可抑制IL-18的生物效应,是IL-18抑制剂,应用IL-18BP可预防内毒素引起的肝脏损伤。
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1700635763 五、肝病并发内毒素血症的临床表现
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1700635765 肝病并发内毒素血症可出现一系列临床表现和并发症,这些并发症往往影响预后。主要有以下几方面:
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1700635767 1.发热
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1700635769 内毒素可直接作用于下丘脑的体温调节中枢,或刺激白细胞释放致热原,使体温升高。血中仅有100ng/ml内毒素就可引起发热反应。重型肝病的无名热可能与此有关。
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