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(2)AmpC酶(头孢菌素酶) AmpC酶(头孢菌素酶)最初是在氨苄西林耐药大肠埃希菌中发现的一种染色体编码的β-内酰胺酶,并且根据其耐药性而命名。因其水解的优先底物是头孢菌素,故又称头孢菌素酶。而现在AmpC酶的概念有了很大的拓展,它代表由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家族,属β-内酰胺酶Bush分类中1类酶,它们在分子结构上具有同源性,都属于分子分类中的C类。AmpC酶存在于大多数肠杆科细菌和铜绿假单胞菌中,分为诱导酶和非诱导酶两类,诱导性AmpC酶存在于肠杆菌、柠檬酸杆菌、普罗威登斯菌、不动杆菌、黏质沙雷菌、小肠结肠炎耶耳森菌、摩氏摩根菌以及铜绿假单胞菌等,可被青霉素类和头孢菌类抗生素诱导;非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺菌、克雷伯菌等,其表达不受β内酰胺类抗生素和其他外部因素的影响,但具有代谢调节性。AmpC酶的表达受amp复合操纵子调控,amp操纵子由4个不连锁基因即ampC、ampR、ampD和ampG组成,ampC是AmpC酶的结构基因;ampR编码诱导性转录调控因子;ampD编码一种新的N-乙酰葡糖胺-L丙氨酸酰胺酶;ampG编码膜结合转运蛋白;目前研究发现,AmpC酶出现由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移趋势,大大提高了AmpC酶的横向传播能力。对于产AmpC酶细菌的感染的治疗可以选择的抗菌药物有:第四代头孢菌素;碳青霉烯类抗生素;对其敏感的非β-内酰胺类抗生素(如氨基苷类、喹诺酮类);常规的青霉素类、第一、二、三代头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺抗生素合剂往往对该类细菌无效。
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(3)碳青霉烯酶 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶,分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。其中B类为金属酶,在Bush分群中为第三组,可由染色体、质粒或转座子介导,由后者编码的获得性金属酶可见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌;A类、D类为丝氨酸酶,属于Bush分群中的2f和2d亚组,A类酶目前主要见于一些肠杆菌科细菌,D类酶主要见于不动杆菌。碳青霉烯类抗生素水解酶包括:①分类属于2f型的A类酶,具有丝氨酸位点,A类碳青霉烯酶较少见。它包括阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1~Sme-3、IMI-1-2酶,以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1、KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-5酶、铜绿假单胞菌中GES-2、GES-3、GES-4、GES-5酶,居泉沙雷菌的SFC-1酶。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3早在碳青霉烯类抗生素应用于临床之前就已存在,是天然来源的碳青霉烯酶。A类碳青霉烯酶都是青霉素酶,对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3不能水解三代头孢菌素,IMI-1、NmcA能被克拉维酸抑制,而Sme-1-3则不被抑制。②分类属于3型的B类酶,也叫金属酶,金属酶不仅对β-内酰胺酶的抑制剂敏感性差,而且能够水解包括碳青霉烯类抗生素(carbapenems)在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素。金属酶分别属于功能分类的Ⅲ类酶和分子生物学分类的B类酶。按水解底物的不同,金属酶分为3组功能亚群3a、3b、3c。3a组金属酶作用底物最广,包括青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素,但氨曲南例外,对头孢菌素类的水解速度通常比碳青霉烯类慢。3b组金属酶主要包括来自气单胞菌属的金属酶CphA/CphA2、ACP、ImiS、AsbM1、ASA-1、A2h以及洋葱伯克霍尔德菌、芳香黄杆菌的金属酶,特别易于水解碳青烯类抗生素,但并不导致青霉素、头孢菌素耐药,属于真正意义上的碳青霉烯类酶。多数金属酶被EDTA抑制后加入Zn2+能恢复活性,但至少有3种来自3b组的酶ACP、AsbM1、ASA-1的活性能被低浓度的Zn2+(≤15μm)抑制。3c亚群目前只包括来自军团菌的金属酶,主要水解头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素。多数金属酶对亚胺培南的水解能力强于美罗培南,但也有例外,蜡样芽孢杆菌Ⅱ酶和3b中的AsbM1对美罗培南的水解能力更强。金属酶对氨曲南的水解能力都很弱。根据氨基酸的同源性,Bush又把金属酶分成三组结构亚型B1、B2、B3。已知的获得性金属酶主要包括IMP、VIM、SPM-1、GIM和SIM型金属酶,都属于B1亚型。只有SPM-1较特殊,是B1亚群和B2亚型的混合体。这些酶不仅存在于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中,还可以通过整合子、转座子或质粒等进行水平扩散。最近,澳大利亚学者从铜绿假单胞菌中分离出一种新的金属酶,命名为AIM-1。③D类β内酰胺酶,又称OXA酶,在Bush分群中属于2d类,对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低,Vmax是水解青霉素的1%~3%,其耐药性的表达有赖于膜透通性降低的协同作用,对苯唑西林的Vmax是青霉素的两倍,对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外,其他酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上,或定位在I型整合子基因盒中,具备向其他菌种转移的能力。由于产碳青霉烯酶细菌耐药机制比较复杂,目前尚无可以高效控制该类产酶菌感染的药物,临床治疗方案还需依赖药敏结果进行制定。单环酰胺类、环丙沙星、庆大霉素对部分产酶株有活性。对于产OXA型碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌,可选用含舒巴坦的复合制剂如头孢哌酮/舒巴坦等,产A类酶菌株可选用第三代头孢菌素。值得注意的是,部分携带碳青霉烯酶基因的菌株对碳青霉烯类抗生素表型敏感,其原因可能是:①沉默型基因的存在;②质粒拷贝数较少,对碳青霉烯类抗生素水解率较低。这种情况下也不宜应用碳青霉烯类抗生素,容易诱导碳青霉烯酶高水平表达。
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2.氨基糖苷类抗生素钝化酶
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氨基糖苷类抗生素钝化酶可修饰抗菌药物分子中某些保持抗菌活性所必需的基团,使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低。这些钝化酶包括酰基转移酶、腺苷转移酶、核苷转移酶以及磷酸转移酶等。目前已经在许多氨基糖苷类抗生素的耐药菌中发现了不同特性的钝化酶。在临床上使用的许多半合成氨基糖苷类抗生素都是根据细菌产生耐药性的机制进行结构改造得到的。如在卡那霉素分子中引进保护基团以免钝化酶修饰(如阿米卡星),或是去除钝化酶修饰的基团(如地贝卡星),或是两者皆有(如阿贝卡星)。
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3.MLS类钝化酶
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MLS(macrolides-lincosamids-streptogramins)类抗菌药物因其结构的差异,细菌产生的钝化酶也有差异。对红霉素具有高度耐受性的肠杆菌属、大肠埃希菌中存在红霉素钝化酶,红霉素钝化酶可水解红霉素和竹桃霉素的大环内酯类抗菌药物,它们对十六元环抗菌药物如交沙霉素、麦迪霉素、蔷薇霉素和螺旋霉素都没有作用。林可霉素类钝化酶在很多葡萄球菌和乳酸杆菌中被发现,使抗菌药物分子的羟基磷酸化或核苷酰化。编码MLS钝化酶的基因主要位于质粒上,最近发现在对链阳菌素A和林可霉素类抗菌药物产生耐药的金黄色葡萄球菌中,存在位于染色体上的编码钝化酶的isa基因。
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4.氯霉素钝化酶
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氯霉素钝化酶是酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)。该酶存在于葡萄球菌、D组链球菌、肺炎链球菌、肠杆菌属和奈瑟球菌中,其编码基因可以定位在染色体上,也可以定位在质粒上。
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三、靶位改变
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抗菌药物进入菌体后作用于特定的靶位,影响细菌的新陈代谢杀灭细菌或抑制细菌的生长,靶位改变后使抗菌药物不能与作用位点结合而发挥抗菌作用,如MRSA由于PBP2a与β-内酰胺抗生素亲和力低,且又能替代其他PBPs的功能,即使在高浓度的β-内酰胺抗生素存在的情况下,仍能生长繁殖,表现出耐药性。肺炎链球菌由于BPP1a, 2a, 2b, 2x的亲和力下降,而呈现对β-内酰胺抗生素的耐药性。各类抗菌药物主要作用靶位改变情况如下。
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1.β-内酰胺类抗生素作用靶位改变
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β-内酰胺类抗生素是临床最常用的抗菌药物,其作用靶位是青霉素结合蛋白(penicillin binding protein, PBPs)。PBPs是一组位于细菌内膜、具有催化作用的酶,参与细菌细胞壁的合成、形态维持和细菌糖肽结构调整等功能。目前研究发现的由PBPs改变而引起的耐药细菌主要有葡萄球菌、肺炎链球菌以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属细菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟菌等。
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(1)甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的耐药机制为产生PBP2a, 其中PBP2a对β-内酰胺类药物亲和力很低,分子量为78kD, 当β-内酰胺类抗生素以共价结合的方式使正常的4种主要PBPs失活,PBP2a可替代完成细胞壁合成的功能,从而产生耐药。表皮葡萄球菌中也存在甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis, MRSE),其耐药机制与MRSA相同。有效药物较少,仅有万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、达托霉素、褐霉素、阿贝卡星、利福霉素等。
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(2)肺炎链球菌有6种PBPs包括PBP1a、1b(100kD)、PBP2a、2x、2b(95~78kD)、PBP3(43kD)。在青霉素耐药肺炎链球菌(penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae, PRSP)中,PBP1a、2a、2x、2b对β-内酰胺类抗生素的亲和力下降。PRSP菌株也常存在主动外排系统。有效药物包括第三代头孢菌素、万古霉素等。
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(3)在革兰阴性细菌中,PBPs改变造成耐药并不重要。实验室研究发现铜绿假单胞菌的PBP3、PBP4、PBP5改变,淋病奈瑟菌的PBP1、PBP2改变,脑膜炎奈瑟菌的PBP2改变与其β-内酰胺类抗生素耐药有关。目前在其他革兰阴性细菌,如肠杆菌属、肺炎克雷伯菌、沙门菌属、变形杆菌属、沙雷菌属以及大肠埃希菌中,PBPs改变有关与耐药性相关的报道较少。
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2.万古霉素作用靶位改变
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万古霉素是一种高分子量的糖肽类抗生素,它和革兰阳性菌的细胞壁肽聚糖前体五肽中的D-丙氨酸-D-丙氨酸末端(D-Ala-D-Ala)结合,抑制细菌细胞壁合成。绝大多数临床的革兰阳性菌均对万古霉素敏感。万古霉素是治疗MRSA临床感染的最为有效的抗菌药物。但由于临床上万古霉素的大量使用导致了万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)的出现。根据VRE对万古霉素和替考拉宁耐药水平、耐药的诱导性和可转移性的差异,可以将已出现的VRE的耐药基因分为5种类型:VanA、VanB、VanC(C1、C2、C3)、VanD、VanE。其耐药机制主要与万古霉素结合靶位改变有关。如VanA, 其耐药基因位于转座子Tn1546上,易于转移,并且伴随vanA基因编码生成多种功能蛋白,包括VanA、VanH、VanS、VanR、VanX、VanY。VanS是膜传感蛋白,可检测到环境中万古霉素的存在,探测到后,VanS就会向应答蛋白VanR发出信号,后者再激活与耐药功能相关的VanH、VanA、VanX的合成。VanH是一种产生D-乳酸的脱氢酶。VanA蛋白是D-乳酸:D-丙氨酸连接酶,它催化生成D-Ala-D-Lac二肽,代替了正常肽聚糖合成五肽前体中的D-Ala-D-Ala二肽。D-Ala-D-Lac在细胞自身染色体编码的作用下与UDP-NAM三肽连接生成新的UDP-NAM五肽前体。万古霉素对该五肽的亲和力很低,无法再与之结合,从而细菌对万古霉素产生耐药。VanX蛋白则是存在于细胞质中的D,D-二肽酶,它解离已生成的D-Ala-D-Ala, 而不水解D-Ala-D-Lac或含D-Ala-D-Lac的五肽前体,从而进一步阻止含D-Ala-D-Ala肽聚糖的正常前体的合成。如果有部分D-Ma-D-Ala逃过了VanX蛋白的水解作用而合成了正常的肽聚糖前体五肽,那由vanA基因簇编码产生VanY蛋白(羧肽酶)仍可以将正常的肽聚糖前体五肽的末端残基(如D-Ala)解离,生成一种万古霉素不能与之结合的四肽,而产生对万古霉素耐药性。目前用来治疗VRE感染的有效抗生素不多,如果药物敏感,可用氯霉素、多西环素或磷霉素。新抑菌剂恶唑烷酮类的利奈唑胺已证明对VRE感染有较好疗效。另一有效的药物为达托霉素是一种新的脂肽类杀菌剂。关键在于预防和控制VRE的流行。所采取措施包括:限制使用头孢噻肟等第三代头孢菌素和万古霉素,用哌拉西林/三唑巴坦代替第三代头孢菌素治疗对万古霉素敏感的肠球菌、革兰阴性菌及厌氧菌,同时采取其他预防感染的措施。VRE还可将糖肽类耐药性转移到毒性更强的细菌如金黄色葡萄球菌,即万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA),造成对人类健康更大的危险。2002年美国疾病控制中心分别确证并公布了两例VRSA载有VanA基因。至今已有9例VRSA报道。
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3.大环内酯类、林可霉素、链阳菌素、四环素类、氨基糖苷类药物作用靶位改变
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此类药物主要通过与细菌核糖体结合,抑制细菌蛋白质合成,而发挥抗菌作用。细菌核糖体由大亚基(50S)、小亚基(30S)构成,亚基中mRNA及蛋白质的改变,可引起与抗菌药物亲和力的变化,而产生对上述几类药物的耐药性。
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(1)大环内酯类耐药菌可合成甲基化酶,使位于核糖体50S亚单位的23S rRNA的腺嘌呤甲基化,导致抗菌药物不能与结合部位结合。因大环内酯类抗菌药物、林可霉素及链阳菌素的作用部位相仿,所以耐药菌对上述3类抗菌药物常同时耐药,称为MLS耐药。此类耐药菌的耐药基因位于质粒或染色体上的erm(erythromycin-resistance methylase)基因,目前至少已发现8类erm基因,常见的有ermA、ermC(葡萄球菌属耐药基因)、ermAM(链球菌属耐药基因)。
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(2)细菌对四环素耐药的主要原因之一是细菌产生基因tetM编码的6.8×103及7.5×103的溶性蛋白,该蛋白与核糖体结合,保护核糖体或其他决定簇,从而阻止四环素对蛋白合成的抑制作用。该基因与多西环素、米诺环素耐药有关。
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(3)细菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶,而有些细菌也可通过编码核糖体蛋白的基因突变导致核糖体结构改变,从而阻止细菌与抗菌药物的结合,如抗结核分支杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等对链霉素的耐药。
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近年来,出现了一种新的由质粒介导的耐药机制——16SrRNA甲基化酶,导致革兰阴性杆菌对庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高度耐药。氨基糖苷类药物结合在原核生物30S核糖体亚基16SrRNA上A位点的一个高度保守基元内,引起核糖体功能的改变,导致细菌蛋白合成过程中转录错误和移位抑制。16SrRNA甲基化酶则通过甲基化16SrRNA A位点的某个或某几个碱基,使氨基糖苷类药物不能与其作用靶点相接合,从而导致细菌耐药。目前,已从多个国家和地区及多种革兰阴性杆菌中检测到编码这种酶的基因,包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA, 介导对多种氨基糖苷类抗生素高度耐药(MIC>512μg/mL)。16SrRNA甲基化酶有的对卡那霉素类和庆大霉素类耐药,有的对卡那霉素类和安普霉素类耐药,而RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和ArmA仅介导对卡那霉素类(包括阿贝卡星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素)和庆大霉素类(庆大霉素、萘替米星、西梭米星、异帕米星)药物耐药,对新霉素、安普霉素和链霉素无作用。这些基因位于质粒和转座子上,具有易于传播和扩散的特点,成为临床抗感染的重要问题。
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4.利福霉素类作用靶位改变
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利福霉素类通过与RNA聚合酶结合,抑制细菌转录过程,而达到抗菌效果。利福霉素耐药细菌,如大肠埃希菌、结核分支杆菌,编码RNA聚合酶β亚基的基因(rpoB)可产生突变,导致其不易与利福霉素类药物相结合,而产生耐药。
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