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2．万古霉素作用靶位改变
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万古霉素是一种高分子量的糖肽类抗生素，它和革兰阳性菌的细胞壁肽聚糖前体五肽中的D-丙氨酸-D-丙氨酸末端（D-Ala-D-Ala）结合，抑制细菌细胞壁合成。绝大多数临床的革兰阳性菌均对万古霉素敏感。万古霉素是治疗MRSA临床感染的最为有效的抗菌药物。但由于临床上万古霉素的大量使用导致了万古霉素耐药肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus, VRE）的出现。根据VRE对万古霉素和替考拉宁耐药水平、耐药的诱导性和可转移性的差异，可以将已出现的VRE的耐药基因分为5种类型：VanA、VanB、VanC（C1、C2、C3)、VanD、VanE。其耐药机制主要与万古霉素结合靶位改变有关。如VanA, 其耐药基因位于转座子Tn1546上，易于转移，并且伴随vanA基因编码生成多种功能蛋白，包括VanA、VanH、VanS、VanR、VanX、VanY。VanS是膜传感蛋白，可检测到环境中万古霉素的存在，探测到后，VanS就会向应答蛋白VanR发出信号，后者再激活与耐药功能相关的VanH、VanA、VanX的合成。VanH是一种产生D-乳酸的脱氢酶。VanA蛋白是D-乳酸：D-丙氨酸连接酶，它催化生成D-Ala-D-Lac二肽，代替了正常肽聚糖合成五肽前体中的D-Ala-D-Ala二肽。D-Ala-D-Lac在细胞自身染色体编码的作用下与UDP-NAM三肽连接生成新的UDP-NAM五肽前体。万古霉素对该五肽的亲和力很低，无法再与之结合，从而细菌对万古霉素产生耐药。VanX蛋白则是存在于细胞质中的D,D-二肽酶，它解离已生成的D-Ala-D-Ala, 而不水解D-Ala-D-Lac或含D-Ala-D-Lac的五肽前体，从而进一步阻止含D-Ala-D-Ala肽聚糖的正常前体的合成。如果有部分D-Ma-D-Ala逃过了VanX蛋白的水解作用而合成了正常的肽聚糖前体五肽，那由vanA基因簇编码产生VanY蛋白（羧肽酶）仍可以将正常的肽聚糖前体五肽的末端残基（如D-Ala）解离，生成一种万古霉素不能与之结合的四肽，而产生对万古霉素耐药性。目前用来治疗VRE感染的有效抗生素不多，如果药物敏感，可用氯霉素、多西环素或磷霉素。新抑菌剂恶唑烷酮类的利奈唑胺已证明对VRE感染有较好疗效。另一有效的药物为达托霉素是一种新的脂肽类杀菌剂。关键在于预防和控制VRE的流行。所采取措施包括：限制使用头孢噻肟等第三代头孢菌素和万古霉素，用哌拉西林／三唑巴坦代替第三代头孢菌素治疗对万古霉素敏感的肠球菌、革兰阴性菌及厌氧菌，同时采取其他预防感染的措施。VRE还可将糖肽类耐药性转移到毒性更强的细菌如金黄色葡萄球菌，即万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)，造成对人类健康更大的危险。2002年美国疾病控制中心分别确证并公布了两例VRSA载有VanA基因。至今已有9例VRSA报道。
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3．大环内酯类、林可霉素、链阳菌素、四环素类、氨基糖苷类药物作用靶位改变
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此类药物主要通过与细菌核糖体结合，抑制细菌蛋白质合成，而发挥抗菌作用。细菌核糖体由大亚基（50S）、小亚基（30S）构成，亚基中mRNA及蛋白质的改变，可引起与抗菌药物亲和力的变化，而产生对上述几类药物的耐药性。
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（1）大环内酯类耐药菌可合成甲基化酶，使位于核糖体50S亚单位的23S rRNA的腺嘌呤甲基化，导致抗菌药物不能与结合部位结合。因大环内酯类抗菌药物、林可霉素及链阳菌素的作用部位相仿，所以耐药菌对上述3类抗菌药物常同时耐药，称为MLS耐药。此类耐药菌的耐药基因位于质粒或染色体上的erm（erythromycin-resistance methylase）基因，目前至少已发现8类erm基因，常见的有ermA、ermC（葡萄球菌属耐药基因）、ermAM（链球菌属耐药基因）。
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（2）细菌对四环素耐药的主要原因之一是细菌产生基因tetM编码的6.8×103及7.5×103的溶性蛋白，该蛋白与核糖体结合，保护核糖体或其他决定簇，从而阻止四环素对蛋白合成的抑制作用。该基因与多西环素、米诺环素耐药有关。
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（3）细菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶，而有些细菌也可通过编码核糖体蛋白的基因突变导致核糖体结构改变，从而阻止细菌与抗菌药物的结合，如抗结核分支杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等对链霉素的耐药。
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近年来，出现了一种新的由质粒介导的耐药机制——16SrRNA甲基化酶，导致革兰阴性杆菌对庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高度耐药。氨基糖苷类药物结合在原核生物30S核糖体亚基16SrRNA上A位点的一个高度保守基元内，引起核糖体功能的改变，导致细菌蛋白合成过程中转录错误和移位抑制。16SrRNA甲基化酶则通过甲基化16SrRNA A位点的某个或某几个碱基，使氨基糖苷类药物不能与其作用靶点相接合，从而导致细菌耐药。目前，已从多个国家和地区及多种革兰阴性杆菌中检测到编码这种酶的基因，包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA, 介导对多种氨基糖苷类抗生素高度耐药（MIC＞512μg/mL)。16SrRNA甲基化酶有的对卡那霉素类和庆大霉素类耐药，有的对卡那霉素类和安普霉素类耐药，而RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和ArmA仅介导对卡那霉素类（包括阿贝卡星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素）和庆大霉素类（庆大霉素、萘替米星、西梭米星、异帕米星）药物耐药，对新霉素、安普霉素和链霉素无作用。这些基因位于质粒和转座子上，具有易于传播和扩散的特点，成为临床抗感染的重要问题。
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4．利福霉素类作用靶位改变
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利福霉素类通过与RNA聚合酶结合，抑制细菌转录过程，而达到抗菌效果。利福霉素耐药细菌，如大肠埃希菌、结核分支杆菌，编码RNA聚合酶β亚基的基因（rpoB）可产生突变，导致其不易与利福霉素类药物相结合，而产生耐药。
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5．喹诺酮类药物作用靶位改变
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喹诺酮可抑制DNA拓扑异构酶活性，阻止DNA复制、修复、染色体分离、转录及其他功能，从而发挥杀菌作用。DNA拓扑异构酶Ⅱ又常称为DNA促旋酶，其基因突变可引起耐药，以大肠埃希菌最为多见。大肠埃希菌gyrA基因序列上，残基67－106区域常发生突变，因而命名为喹诺酮类药物耐药区（QRDR)。GyrA的改变产生耐药可能有两种解释，一种是由于酶结构的改变引起空间上的障碍，阻止喹诺酮进入喹诺酮作用区；另一种是由于物理、化学变化干扰喹诺酮－酶-DNA相互作用。每一种gyr A突变都可造成对喹诺酮类抗菌药物产生对药物的低水平耐药。当拓扑异构酶Ⅱ、Ⅳ均发生变化，则耐药程度更大。喹诺酮类抗菌药物耐药大多是由染色体突变引起的，但也可能由含Qnr基因的质粒介导。Qnr蛋白保护DNA不受喹诺酮类药物的影响而降低敏感性，如萘啶酸。Qnr蛋白包括QnrA蛋白、QnrB蛋白和QnrS蛋白，在亚洲广泛存在于可被克拉维酸抑制的超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的头孢菌素酶的肠杆菌科中，并快速蔓延。
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6．磺胺类药物作用靶位改变
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由于细菌不能使用外源性叶酸，磺胺类药物可通过抑制二氢叶酸合成酶或二氢叶酸还原酶，使细菌发生叶酸代谢障碍，而发挥抑菌作用。耐磺胺类药物亲和力降低，或靶位酶的合成量增加。
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四、主动外排
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近年发现有些多重耐药的菌株具有底物广泛的主动泵出药物的系统，这种系统能将进入细胞内的多种抗菌药物主动泵出细胞外，使菌体内抗生素蓄积减少，最低抑菌浓度（MIC）增加，从而导致细胞获得耐药性。氟喹诺酮类、β-内酰胺类（包括第四代头孢菌素、亚胺培南等）、氯霉素、四环素、大环内酯类、磺胺类和氟康唑等抗菌药物均能被其泵出细胞外，甚至还发现β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸也能被其泵出细胞外。但是，目前尚未发现能够泵出氨基糖苷类药物的主动外排系统，可能与其独特的化学结构有关。
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主动外排系统首先是在大肠埃希菌对四环素的耐药机制的研究中被发现的，是一种被称为Tet的蛋白。此后从金黄色葡萄球菌的染色体上克隆到一个主动外排泵基因norA, 该基因的过度表达是导致部分金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类药物耐药的直接原因。现已证明其编码的产物NorA为细菌膜上的多重药物外排泵，能将细菌体内的氟喹诺酮类药物、嘌呤霉素、氯霉素和一些阳离子染料泵出细菌外。虽然在具有药物主动外排机制的氟喹诺酮类耐药菌株中，也发现同时存在药物作用靶位的改变，但仅药物主动外排机制单独作用才可导致细菌发生高水平氟喹诺酮类耐药。
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细菌的主动外排系统根据其超分子结构、机理和顺序的同源性等可以将其分为四大类：①主要易化超家族（major facilitator superfamily, MFS)，与哺乳动物的葡萄糖易化转运器具有同源性；②耐药结节分化家族〔resistance-nodulation division（RND）family〕，包括能够泵出镉、钴和镍离子的转运蛋白；③葡萄球菌多重耐药家族〔staphylococal multidrugresistance（SMR）family〕，由比较小的含有四个跨膜螺旋的转运器组成；④ATP组合盒〔ATP-bindingcassette（ABC）〕转运器，包括两个跨膜区和两个ATP结合亚单位。前三类主动泵出系统运行所需能量由氢离子药物反转运体逆转H+，形成H+浓度差而产生的势能所提供，而第四类利用ATP水解所释放的自由能排出细胞内有毒物质。主动外排系统作为细菌耐药机制之一，广泛存在于革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰阴性菌（如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌等）、真菌及哺乳类细胞（如癌细胞）中，常见于对大环内酯类、四环素类和喹诺酮类抗菌药物的主动泵出。
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肺炎链球菌可主动外排大环内酯类。革兰阴性菌可主动外排喹诺酮类，有些细菌的主动泵出系统仅导致低水平的耐药，如与其他突变同时存在则表现出明显耐药作用。近年发现有些多重耐药的菌株具有底物广泛的主动泵出药物的系统，如铜绿假单胞菌至少有4种膜主动泵出药物系统共存。
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五、细菌生物被膜的形成
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细菌生物被膜（Biofilm）是指细菌黏附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药物作用于菌体。细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生高度耐药性，其原因有：①细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透。②吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解。③细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感。④生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用。
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铜绿假单胞菌、葡萄球菌、肠杆菌、沙雷菌属、肺炎链球菌均可产生生物被膜，其厚度不一。其中最常见的临床致病菌为铜绿假单胞菌。由细菌生物被膜引起的感染主要有两种，一种是生物医学材料相关感染，如导管、插管、生物材料移植物（心脏瓣膜、骨关节等）相关感染；另一种为细菌生物被膜疾病，如肺囊性纤维化、慢性骨髓炎等。细菌生物被膜相关感染往往反复发作、难以治愈。用抗菌药物治疗时，14和15元环大环内酯类药物如克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、阿奇霉素等可抑制细菌合成多糖蛋白复合物，提高喹诺酮类药物对细菌生物被膜的渗透性和对细菌的杀菌活性。大剂量的哌拉西林和妥布霉素、亚胺培南、环丙沙星对已形成稳态的生物被膜有一定疗效，但不能彻底清除被膜。
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六、结束语
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总之，细菌耐药机制日趋复杂，且耐药性常为多种机制并存。抗菌药物在医院、农场、社区滥用是抗菌药物耐药的主要原因。不当的抗菌药物的使用对细菌耐药产生筛选作用，使耐药菌株有更好的生存环境，导致耐药菌株的流行。因此应针对致病菌，合理选择抗菌药物、制定个体化给药方案具有重要意义。近来，循环使用抗菌药物的概念又重新活跃起来，其依据是恢复调节基因发生突变理论，有人推荐，在经验性治疗严重的全身感染时，β-内酰胺类抗生素应循环使用，即先用第三或第四代头孢菌素，然后停下来换用酶抑制剂复合制剂，再停下来换用碳青霉烯类抗生素，再回到使用第三或第四代头孢菌素，如此依次循环。美国芝加哥一所教学医院，由于医院制定了一套控制抗菌药物使用的对策，10年来，第三代头孢菌素一直保持了较高的抗菌活性，延迟了耐药性的发展。另外，需要对致病菌的耐药性进行监测，预测耐药细菌的流行情况。细菌对抗菌药物的耐药性可以是先天的或基因突变产生的，但引起耐药菌的流行主要是外源性获得耐药，如带有耐药基因的质粒或转座子在细菌之间的传递。质粒可以通过接合、转导、转化等在细菌间传播。含耐药基因的转座子带有转座酶、溶解酶及其抑制物基因，可以随机转位插入复制体或任一位置而导致细菌产生耐药性。因此，对于耐药细菌的感染，应注意严格执行消毒隔离制度，避免或减少医源性交叉感染。
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【思考题】
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