1700636120
孔蛋白本身的功能状态的变化也可影响其通透性。研究表明，孔蛋白在生理状态下，一般处于两种功能状态，开放状态和关闭状态，多氨基物质能使之关闭。细菌可随外界渗透压的变化产生不同程度的多氨基物质，从而调节孔蛋白的功能状态。但如何来实现这种调节目前尚不清楚。
1700636121
1700636122
总而言之，外膜屏障在细菌耐药过程中起着重要作用。Omps是维系细胞内外小分子亲水性物质交换的通道，Omps的减少或缺失使细菌耐药性大大增强。进一步研究其调控机制将有助于耐药机制的最终阐明。
1700636123
1700636124
二、产生灭活酶或钝化酶
1700636125
1700636126
细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性。目前，细菌产生的灭活酶主要有β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和MLS（大环内酯类—克林霉素类—链阳菌素类）类钝化酶，其中最重要的是β-内酰胺酶。
1700636127
1700636128
1．β-内酰胺酶
1700636129
1700636130
β-内酰胺酶是一类由细菌产生的能够降解β-内酰胺类抗生素（如青霉素类，头孢菌素类，碳青霉烯类抗生素等），使其抗菌活性减弱或消失的酶。至今，已发现β-内酰胺酶有四百多种，目前普遍采用的分类方法有两种：一种为分子生物学的分类，根据末端氨基酸序列及编码基因的位点来分，可分为四类：A类，为丝氨酸酶，由质粒编码；B类，为金属酶，由染色体编码；C类，为丝氨酸酶，由染色体编码；D类，为丝氨酸酶，由质粒编码。另一种为临床上较为实用的分类方法，即1995年Bush等的分类方法，此分类方法是根据各种酶的等电点、水解底物、是否被克拉维酸抑制及酶的分子结构类别来分，主要分成四类：Ⅰ类：由染色体编码的头孢菌素酶，不能被克拉维酸抑制；Ⅱ类：通常可被克拉维酸抑制，根据对各种β-内酰胺类抗生素的优先水解顺序分为6个亚组；Ⅲ类：金属β-内酰胺酶，含有活性位点锌而不是丝氨酸，水解底物广（包括亚胺培南）；Ⅳ类：主要由染色体编码、耐酶抑制剂的青霉素酶。β-内酰胺酶的分类方法和特点见表9-10。
1700636131
1700636132
表9-10 β-内酰胺酶的分类方
1700636133
1700636134
1700636135
1700636136
1700636137
在革兰阳性菌中β-内酰胺酶较为简单，只有两种：青霉素酶和头孢菌素酶，研究的人较少。革兰阴性菌β-内酰胺酶种类较为复杂，几乎所有的肠杆菌科细菌其β-内酰胺酶均阳性。Jacoby和Bush等学者建立了各类β-内酰胺酶的网站（http://www.lahey.org/studies/webt.htm.)。截止2008年11月18日，共发现近400余种β-内酰胺酶，其中TEM型约170余种，SHV型约110余种，CTX-M型82种，OXA型有135种，以及其他基因型（www.Lahey.org/studies/)。其中超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶愈来愈受到重视。
1700636138
1700636139
（1）超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs) ESBLs是由质粒介导的能水解氧亚氨基β-内酰胺抗生素，并可被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸等抑制的一类β-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。根据2001年Bradford的分类方法，将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型、其他型五类。此类酶不仅可水解青霉素类和第一、第二、第三代头孢菌素，还能水解单酰胺菌素（如氨曲南 aztreonam），甚至第四代头孢菌素；但含有7-α甲基侧链的头霉素类如头孢西丁、头孢替坦等相对稳定。除了TEM-50，68同时具有ESBLs和IRT（耐酶抑制剂）的特点外，其余的ESBLs都能被克拉维酸、舒巴坦所抑制。各类型的ESBLs最优化的底物各不相同。ESBLs主要由克雷伯菌属、大肠埃希菌和奇异变形杆菌产生，也可由其他肠杆菌科细菌、不动杆菌以及铜绿假单胞菌产生。对产ESBLs细菌引起的感染，碳青霉烯类抗生素如亚胺培南／西司他丁、美罗培南等疗效最确切；复合制剂如头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／三唑巴坦也有较好的疗效。头霉素类，如头孢西丁、头孢替坦等，治疗成功率相对较低，最多只有70％。环丙沙星、阿米卡星等必须根据药敏结果选择。
1700636140
1700636141
（2）AmpC酶（头孢菌素酶） AmpC酶（头孢菌素酶）最初是在氨苄西林耐药大肠埃希菌中发现的一种染色体编码的β-内酰胺酶，并且根据其耐药性而命名。因其水解的优先底物是头孢菌素，故又称头孢菌素酶。而现在AmpC酶的概念有了很大的拓展，它代表由革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶组成的一个酶家族，属β-内酰胺酶Bush分类中1类酶，它们在分子结构上具有同源性，都属于分子分类中的C类。AmpC酶存在于大多数肠杆科细菌和铜绿假单胞菌中，分为诱导酶和非诱导酶两类，诱导性AmpC酶存在于肠杆菌、柠檬酸杆菌、普罗威登斯菌、不动杆菌、黏质沙雷菌、小肠结肠炎耶耳森菌、摩氏摩根菌以及铜绿假单胞菌等，可被青霉素类和头孢菌类抗生素诱导；非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺菌、克雷伯菌等，其表达不受β内酰胺类抗生素和其他外部因素的影响，但具有代谢调节性。AmpC酶的表达受amp复合操纵子调控，amp操纵子由4个不连锁基因即ampC、ampR、ampD和ampG组成，ampC是AmpC酶的结构基因；ampR编码诱导性转录调控因子；ampD编码一种新的N-乙酰葡糖胺-L丙氨酸酰胺酶；ampG编码膜结合转运蛋白；目前研究发现，AmpC酶出现由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移趋势，大大提高了AmpC酶的横向传播能力。对于产AmpC酶细菌的感染的治疗可以选择的抗菌药物有：第四代头孢菌素；碳青霉烯类抗生素；对其敏感的非β-内酰胺类抗生素（如氨基苷类、喹诺酮类）；常规的青霉素类、第一、二、三代头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺抗生素合剂往往对该类细菌无效。
1700636142
1700636143
（3）碳青霉烯酶 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。其中B类为金属酶，在Bush分群中为第三组，可由染色体、质粒或转座子介导，由后者编码的获得性金属酶可见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌；A类、D类为丝氨酸酶，属于Bush分群中的2f和2d亚组，A类酶目前主要见于一些肠杆菌科细菌，D类酶主要见于不动杆菌。碳青霉烯类抗生素水解酶包括：①分类属于2f型的A类酶，具有丝氨酸位点，A类碳青霉烯酶较少见。它包括阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1-2酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1、KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-5酶、铜绿假单胞菌中GES-2、GES-3、GES-4、GES-5酶，居泉沙雷菌的SFC-1酶。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3早在碳青霉烯类抗生素应用于临床之前就已存在，是天然来源的碳青霉烯酶。A类碳青霉烯酶都是青霉素酶，对亚胺培南的水解活性强于美罗培南，可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药。NMC-A、IMI-1、Sme-1-3不能水解三代头孢菌素，IMI-1、NmcA能被克拉维酸抑制，而Sme-1-3则不被抑制。②分类属于3型的B类酶，也叫金属酶，金属酶不仅对β-内酰胺酶的抑制剂敏感性差，而且能够水解包括碳青霉烯类抗生素（carbapenems）在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素。金属酶分别属于功能分类的Ⅲ类酶和分子生物学分类的B类酶。按水解底物的不同，金属酶分为3组功能亚群3a、3b、3c。3a组金属酶作用底物最广，包括青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素，但氨曲南例外，对头孢菌素类的水解速度通常比碳青霉烯类慢。3b组金属酶主要包括来自气单胞菌属的金属酶CphA/CphA2、ACP、ImiS、AsbM1、ASA-1、A2h以及洋葱伯克霍尔德菌、芳香黄杆菌的金属酶，特别易于水解碳青烯类抗生素，但并不导致青霉素、头孢菌素耐药，属于真正意义上的碳青霉烯类酶。多数金属酶被EDTA抑制后加入Zn2+能恢复活性，但至少有3种来自3b组的酶ACP、AsbM1、ASA-1的活性能被低浓度的Zn2+（≤15μm）抑制。3c亚群目前只包括来自军团菌的金属酶，主要水解头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素。多数金属酶对亚胺培南的水解能力强于美罗培南，但也有例外，蜡样芽孢杆菌Ⅱ酶和3b中的AsbM1对美罗培南的水解能力更强。金属酶对氨曲南的水解能力都很弱。根据氨基酸的同源性，Bush又把金属酶分成三组结构亚型B1、B2、B3。已知的获得性金属酶主要包括IMP、VIM、SPM-1、GIM和SIM型金属酶，都属于B1亚型。只有SPM-1较特殊，是B1亚群和B2亚型的混合体。这些酶不仅存在于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，还可以通过整合子、转座子或质粒等进行水平扩散。最近，澳大利亚学者从铜绿假单胞菌中分离出一种新的金属酶，命名为AIM-1。③D类β内酰胺酶，又称OXA酶，在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，Vmax是水解青霉素的1％～3％，其耐药性的表达有赖于膜透通性降低的协同作用，对苯唑西林的Vmax是青霉素的两倍，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其他酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力。由于产碳青霉烯酶细菌耐药机制比较复杂，目前尚无可以高效控制该类产酶菌感染的药物，临床治疗方案还需依赖药敏结果进行制定。单环酰胺类、环丙沙星、庆大霉素对部分产酶株有活性。对于产OXA型碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌，可选用含舒巴坦的复合制剂如头孢哌酮／舒巴坦等，产A类酶菌株可选用第三代头孢菌素。值得注意的是，部分携带碳青霉烯酶基因的菌株对碳青霉烯类抗生素表型敏感，其原因可能是：①沉默型基因的存在；②质粒拷贝数较少，对碳青霉烯类抗生素水解率较低。这种情况下也不宜应用碳青霉烯类抗生素，容易诱导碳青霉烯酶高水平表达。
1700636144
1700636145
2．氨基糖苷类抗生素钝化酶
1700636146
1700636147
氨基糖苷类抗生素钝化酶可修饰抗菌药物分子中某些保持抗菌活性所必需的基团，使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低。这些钝化酶包括酰基转移酶、腺苷转移酶、核苷转移酶以及磷酸转移酶等。目前已经在许多氨基糖苷类抗生素的耐药菌中发现了不同特性的钝化酶。在临床上使用的许多半合成氨基糖苷类抗生素都是根据细菌产生耐药性的机制进行结构改造得到的。如在卡那霉素分子中引进保护基团以免钝化酶修饰（如阿米卡星），或是去除钝化酶修饰的基团（如地贝卡星），或是两者皆有（如阿贝卡星）。
1700636148
1700636149
3．MLS类钝化酶
1700636150
1700636151
MLS（macrolides-lincosamids-streptogramins）类抗菌药物因其结构的差异，细菌产生的钝化酶也有差异。对红霉素具有高度耐受性的肠杆菌属、大肠埃希菌中存在红霉素钝化酶，红霉素钝化酶可水解红霉素和竹桃霉素的大环内酯类抗菌药物，它们对十六元环抗菌药物如交沙霉素、麦迪霉素、蔷薇霉素和螺旋霉素都没有作用。林可霉素类钝化酶在很多葡萄球菌和乳酸杆菌中被发现，使抗菌药物分子的羟基磷酸化或核苷酰化。编码MLS钝化酶的基因主要位于质粒上，最近发现在对链阳菌素A和林可霉素类抗菌药物产生耐药的金黄色葡萄球菌中，存在位于染色体上的编码钝化酶的isa基因。
1700636152
1700636153
4．氯霉素钝化酶
1700636154
1700636155
氯霉素钝化酶是酰基转移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT)。该酶存在于葡萄球菌、D组链球菌、肺炎链球菌、肠杆菌属和奈瑟球菌中，其编码基因可以定位在染色体上，也可以定位在质粒上。
1700636156
1700636157
三、靶位改变
1700636158
1700636159
抗菌药物进入菌体后作用于特定的靶位，影响细菌的新陈代谢杀灭细菌或抑制细菌的生长，靶位改变后使抗菌药物不能与作用位点结合而发挥抗菌作用，如MRSA由于PBP2a与β-内酰胺抗生素亲和力低，且又能替代其他PBPs的功能，即使在高浓度的β-内酰胺抗生素存在的情况下，仍能生长繁殖，表现出耐药性。肺炎链球菌由于BPP1a, 2a, 2b, 2x的亲和力下降，而呈现对β-内酰胺抗生素的耐药性。各类抗菌药物主要作用靶位改变情况如下。
1700636160
1700636161
1．β-内酰胺类抗生素作用靶位改变
1700636162
1700636163
β-内酰胺类抗生素是临床最常用的抗菌药物，其作用靶位是青霉素结合蛋白（penicillin binding protein, PBPs)。PBPs是一组位于细菌内膜、具有催化作用的酶，参与细菌细胞壁的合成、形态维持和细菌糖肽结构调整等功能。目前研究发现的由PBPs改变而引起的耐药细菌主要有葡萄球菌、肺炎链球菌以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属细菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟菌等。
1700636164
1700636165
（1）甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）的耐药机制为产生PBP2a, 其中PBP2a对β-内酰胺类药物亲和力很低，分子量为78kD, 当β-内酰胺类抗生素以共价结合的方式使正常的4种主要PBPs失活，PBP2a可替代完成细胞壁合成的功能，从而产生耐药。表皮葡萄球菌中也存在甲氧西林耐药表皮葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis, MRSE)，其耐药机制与MRSA相同。有效药物较少，仅有万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、达托霉素、褐霉素、阿贝卡星、利福霉素等。
1700636166
1700636167
（2）肺炎链球菌有6种PBPs包括PBP1a、1b（100kD）、PBP2a、2x、2b（95～78kD）、PBP3（43kD）。在青霉素耐药肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae, PRSP）中，PBP1a、2a、2x、2b对β-内酰胺类抗生素的亲和力下降。PRSP菌株也常存在主动外排系统。有效药物包括第三代头孢菌素、万古霉素等。
1700636168
1700636169
（3）在革兰阴性细菌中，PBPs改变造成耐药并不重要。实验室研究发现铜绿假单胞菌的PBP3、PBP4、PBP5改变，淋病奈瑟菌的PBP1、PBP2改变，脑膜炎奈瑟菌的PBP2改变与其β-内酰胺类抗生素耐药有关。目前在其他革兰阴性细菌，如肠杆菌属、肺炎克雷伯菌、沙门菌属、变形杆菌属、沙雷菌属以及大肠埃希菌中，PBPs改变有关与耐药性相关的报道较少。