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由于布约的观点与加尔越来越不受欢迎的颅相学之间存在联系，再加上弗卢朗充分的实验证据，这使布约的观点最初鲜有支持者。此外，还有许多明确的反例。1840年，法国病理学家加布里埃尔·安德拉尔描述了14例丧失讲话能力的病人。这些病人的尸检结果显示，他们的额叶并没有损伤。另一方面，许多额叶受损的病人仍然可以正常讲话。安德拉尔总结说，认为脑的特定部分参与了语言输出“还为时过早”。[29] 但这些发现对布约几乎没有产生任何影响，他对自己的观点非常有信心，甚至悬赏500法郎，寻找额叶受损但没有语言障碍的病人（他最终在1865年支付了赏金）。[30]
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1861年2月，巴黎的法国人类学学会主办了一系列关于脑的大小与心智能力的辩论。法国外科医生保罗·布罗卡（Paul Broca）认为，脑的大小与智力之间存在明显的联系，他还指出脑在男性和女性之间以及不同的种族之间可能存在差异。[31] 布罗卡的观点是对美国医生塞缪尔·莫顿1839年提出的观点的拓展。使用不同种族的颅骨测量数据，莫顿确定了这些颅骨的容量，并将其与所谓的智力差异关联了起来。莫顿毫不意外地发现，他所谓的“白种人”在智力上优于其他“种族”，这反映在他们的颅骨大小上。[32]
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在这些辩论中，与布罗卡针锋相对的是法国动物学家路易-皮埃尔·格拉蒂奥雷。格拉蒂奥雷曾采用比较解剖学的方法把大脑分成四个叶，并根据覆盖它们的颅骨依次将其称为“额叶”、“顶叶”、“颞叶”和“枕叶”，这种命名法一直沿用至今。此外，他还证明了大脑的沟回在同一个物种的不同个体间是一致的。[33] 格拉蒂奥雷认为，心智和脑都是不可分割的，不存在功能的分区，颅腔容量和智力之间也没有简单的联系。
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针对格拉蒂奥雷的观点，布约的女婿、内科医生欧内斯特·奥比坦提供了一些令人震惊的证据，以一个试图用手枪自杀的巴黎病人为例，证明了脑功能定位的存在。枪伤使这个可怜的病人的前额叶被直接暴露了出来。在治疗这个病人的过程中（最终还是失败了），奥比坦做了一个可怖的实验，很容易让人联想到1700年前盖伦用猪做的研究：
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在病人说话的时候，我把一个大的压舌片的平端放在他的脑的前叶上轻轻按压。病人的讲话立刻就停止了，已经开始讲出的词也没有讲完。按压一结束，讲话就恢复了。在这个病人的脑叶上非常小心地进行按压，对脑的一般功能没有影响，语言能力是唯一受损的官能，并且只有在按压前叶时语言能力才会暂时丧失。[34]
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这有力地说明布约是正确的，而脑的前部确实是说话所必需的。
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不到两个月后，一个偶然的事件为布罗卡提供了测试这个想法的机会。1861年4月，在法国人类学学会的一次会议上，布罗卡向他的同行们展示了一个刚过世不久的51岁老人的脑。这个人生前已经有21年无法说话了，他唯一能重复发出的声音就是“坦、坦”。因此，在他作为住院病人居住了20多年的医院里，人们称他为“坦”。“坦”的真名是路易·勒博涅，他一生都患有癫痫，却能从事鞋楦匠人的日常工作。30岁时，他突然失去了说话的能力。[35] 虽然他在入院时被诊断为身体和智力都正常，但他的身体右侧逐渐瘫痪，视力也不断减退。1861年4月12日，勒博涅因严重的坏疽被收入布罗卡的外科病房，这是布罗卡第一次见到他。虽然勒博涅不会说话也不会写字，但他能看懂时间，还能通过打响指来表达数字。布罗卡的印象是，虽然勒博涅无法通过语言表达自己的想法，但他比看起来更聪明。五天后，可怜的勒博涅去世了。尸检结果显示他的大脑出现了一系列的病变，主要集中在左侧额叶。布罗卡总结说：“发现的一切都让我相信，在这个病例中，大脑额叶的损伤是语言输出能力丧失的原因。”[36]
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布罗卡很快发表了一篇论文，详细地陈述了他的观点。在这篇论文中，他把勒博涅的情况与布约关于语言输出功能定位于额叶的观点联系了起来。[37] 他还对勒博涅的脑进行了详细的解剖学描述，将功能的逐渐丧失与病变的扩散进行了一一对比，从而进一步说明了一些官能是定位在脑中特定的区域的。虽然布罗卡坚持说他无意使加尔的颅相学在科学上受到重视，但他使用的术语完全是颅相学的：他声称正在探索口语的官能及其在脑中对应的潜在功能单位。
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几个月后，又有一名病人转诊到布罗卡处。这位髋部骨折的病人名叫勒隆先生，他在5个月前失去了说话的能力，只能说出几个字，其中包括“勒洛”——这是他在努力读出自己的姓氏。入院近两周后，勒隆去世。尸检结果显示，他的左额叶有一处病灶，与在勒博涅脑中观察到的病灶所在的区域完全相同。[38] 布罗卡在报告中说，当他发现这一点时，他感觉自己“震惊到接近心神恍惚的地步”。然而，他还是更愿意把自己的工作放在布约理论的背景之下，认为整个额叶都参与语言的输出功能。布罗卡声称，这两名患者大脑的左侧均表现出相同的、局域化的病变，这纯粹是一种巧合。[39]
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在收集了8例语言输出能力缺失或失语症病例后，布罗卡小心翼翼的态度开始消退，因为所有这些病例的状况都与左额叶同一区域的损伤有关。1863年4月，布罗卡发表了一篇论文，陈述了这些结果，但文中仍旧充满了谨慎的态度，这表明弗卢朗的反定位主义思想在当时仍占主导地位：
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这里我们有8个病例的病变位于第三额回的后三分之一处。这个数字似乎大到足以做出一些强有力的推测。颇为值得注意的是，在所有这些病人中，病灶都在左侧。我不敢从中得出任何结论，我等待着更多的发现。[40]
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布罗卡刚发表这些结果后不久，他就发现自己卷入了一场痛苦的优先权纠纷中。古斯塔夫·达克斯是一名蒙彼利埃的医生，他声称在19世纪早些时候，他的父亲马克·达克斯观察到了40例病例，显示失语与左额叶损伤有关。小达克斯声称，他的父亲于1836年在蒙彼利埃的一次医学会议上汇报了这些结果，但至今没有找到此事的任何痕迹。1863年3月，古斯塔夫·达克斯向法国科学院提交了两篇论文，一篇是他父亲在1836年写的，另一篇是他根据自己的观察写的。两篇论文显示左额叶的病变与语言障碍有关。[41]
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很明显，布罗卡不知道达克斯父子的研究工作，而且即使没有达克斯父子的研究工作，布罗卡最终也会得出那个不可避免的结论——语言输出能力是由左额叶的一个区域产生的，这个区域现在被称为“布罗卡区”（Broca’s area）。不过当达克斯的论文最终在1865年4月发表时，这两篇论文为布罗卡的主张提供了有力的支持。虽然小达克斯的解剖学证据不如布罗卡的精确，但他已经收集到了大量的数据来支持他关于语言输出功能定位的假说。达克斯重新分析了一系列的病例研究，其中包括布约使用过的那些病例。他描述了140个案例，其中87个出现了左额叶病变和语言输出能力丧失，而53个出现了右额叶病变但没有丧失语言输出能力。达克斯总结说：“大脑中的语言输出功能单位找到了。”[42]
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布罗卡被达克斯的优先权声明弄得心烦意乱，他发表了一篇很长的论文，指出达克斯父子的工作对自己的观点没有影响，并且提供了新的证据来强化自己的论点。这些证据正是他两年前所说的他等待的更多发现。布罗卡描述了身体右侧出现瘫痪的病人往往伴有语言输出障碍，而右侧瘫痪表明大脑左侧有病变。这种语言障碍并不是口腔或咽喉的运动障碍导致的，也不是对语言的理解有障碍导致的，而是明显与清晰表达的能力有关。
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布罗卡的观点意味着，对于一个非常特定的功能，负责的是大脑一侧半球上的某个特定区域，这给布罗卡带来了一个大问题。从解剖学的角度来看，大脑的两个半球似乎完全相同。而且众所周知，当器官成对存在或形态对称时，两个半边的功能往往都完全相同。虽然大脑的两侧没有明显的解剖学差异，但布罗卡指出，从发育的角度来看，两个半球并不完全相同：在胚胎发育时期，左半球比右半球发育得早，这也许提示两者在功能上存在差异。此外，大多数人都是右撇子，这可能是左脑半球发育更早的缘故。布罗卡认为，大脑的其他区域也可能参与语言功能，原则上讲，通过训练可能恢复某些受损的功能。布罗卡的结论一如既往地谨慎，他坚持认为“这并不意味着两个大脑半球之间存在功能上的不一致”。[43]
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不久之后，年轻的德国医生卡尔·韦尼克（Carl Wernicke）揭示了布罗卡的发现所隐含的复杂性。1874年，韦尼克描述了一名女病人的情况。她能说话，但语无伦次，也无法理解语言。韦尼克记录道，“病人完全无法理解她听到的每句话”。[44] 韦尼克的结论是，整个语言能力都位于布罗卡确定的颞叶区域的“可能性很小”。他认为，虽然言语产生于布罗卡区，但其他区域，包括现在被称为“韦尼克区”（Wernicke’s area）的大脑后部区域，都参与了语言的理解。韦尼克并不是简单地将不同的语言要素定位在了不同的区域，他的论点是，语言理解作为一个整体功能在脑中的分布是高度分散的。[45]
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在寻找语言功能局域化定位的更有力证据时，研究者面临着种种困难，其中一部分被布雷斯特的外科医生安吉·杜瓦尔教授在1873年清楚地指了出来。在列举了一系列支持语言功能定位于左半球的病例后，杜瓦尔强调了每个人都面临的方法学问题：
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这些大量的事实足以构成间接证明，但在生理学上，我们更偏好由动物实验提供的直接证明。但动物不能用来研究它们不具备的功能。因此，我们必须等待偶然事故在人脑上产生损伤，指望这些损伤与我们在活体解剖实验中制造的损伤类似。[46]
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杜瓦尔的道德顾虑为他赢得了称赞，但在19世纪70年代结束之前，科学家们便开始相信功能在脑中具有定位，这并不是因为意外或疾病造成的损伤，而是部分由于在一个人身上进行的可怕而可耻的实验。
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1874年1月26日，30岁的玛丽·拉弗蒂住进了辛辛那提的好撒玛利亚人医院（Good Samaritan Hospital）。玛丽身材瘦小，是一名家仆。一段时间以来，她的头皮上出现了一种可怕的溃疡，溃疡慢慢地侵蚀了她的部分颅骨，露出了里面的脑组织。尽管处于这种状况，玛丽仍旧保持着和颜悦色。但感染已经开始加重，在那个还没有抗生素的时代，她的前景并不乐观。42岁的外科医生罗伯茨·巴索洛（Roberts Bartholow）教授见了玛丽，并向玛丽阐述了他想实施的一个手术。显然在得到玛丽的同意后，巴索洛在她左脑暴露的表面下植入了两根细长的电极，然后开启了一个能产生微弱电流的发电机。
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结果是戏剧性的：玛丽的右臂和右腿肌肉收缩并向前移动，同时她的手指向外伸展。当巴索洛将电极植入玛丽的后脑时，她的眼睛颤动、瞳孔放大，并描述说她的右腿和右臂“有一种非常强烈且难受的刺痛感”。巴索洛的报告还记录道：“尽管她显然感到很痛苦，但她还是面带微笑，仿佛觉得这很有趣。”巴索洛毫无畏惧地继续他的实验，把电极植入玛丽大脑的另一侧。接下来的一幕令人担忧：“她的面部表情表现出极大的悲痛，她开始哭泣”，但巴索洛继续实验，直到这个可怜的女人癫痫发作，失去了知觉。过了二十分钟，玛丽醒了过来，并说自己感到虚弱头晕。但巴索洛继续实验，重复用电刺激玛丽的脑，这产生了与此前类似的痛苦效果，但没有引发癫痫。
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两天后，玛丽再次被带到巴索洛的诊疗室，他再次将电极植入玛丽的大脑。这次使用的是由60个电池产生的直流电，这些电池装在一个玻璃罐里，而玻璃罐则放置在一个气派的木柜里。随着玛丽脸色苍白，嘴唇发青，实验很快就停止了。她表示自己感到头晕，右侧身体也开始痉挛。巴索洛对玛丽的身体状态很担心，因此让助手给玛丽使用了氯仿来减轻疼痛。第二天，玛丽连床都下不了，到晚上时，她突然癫痫发作，导致右侧身体完全瘫痪。过了一会儿她就去世了，巴索洛没有报告她确切的死亡时间。
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几周后，巴索洛于1874年4月发表了一篇关于他这次实验的简短报告。这立即引发了一场风波，不仅是因为其中戏剧化的内容，还因为实验的方式有悖伦理。美国医学会批评了巴索洛的工作，因为这是在一个人身上做实验。《英国医学杂志》则发表了巴索洛一篇半道歉式的文章，巴索洛在文中对他的研究结果“是以对病人造成部分伤害为代价而获得的”表示抱歉。他甚至承认重复这样的实验“将是最大程度的犯罪”。[47] 英国脑生理学家大卫·费里尔（David Ferrier）警告说，无论巴索洛的研究结果多么有趣，“实验的过程都对生命造成了危险，因此不应该受到赞扬，也不可能被重复”。[48]
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