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霍珀的书十分厚重、极为详细、看似合理,它费尽精力去缓慢发掘,但其主张仍具有迷惑性,而且成功地引起公众对OPV理论更广泛的关注。一些AIDS研究员(包括菲丽丝· 卡吉和马克思·埃塞克斯),早已知道猴子细胞中的SIV引起的疫苗感染至少是理论上的可能;他们已经对疫苗生产线进行筛选,并未发现疫苗污染的情况,紧随汤姆·柯蒂斯,霍伯提出了从关注转到控诉的观点。他书中大量的信息和激烈的争辩并没有证明其基本的论点——科普罗夫斯基的疫苗是由感染了HIV的大猩猩细胞制成的。但他的文章中的确提出了疫苗可能是由已经感染了的大猩猩细胞制成的这种可能性。
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后来事情的可能性对事实让了步。那真正发生了什么?证据在哪里?一位名叫威廉·汉弥尔顿(William Hamilton)的著名进化生物学家相信OPV理论值得研究,在他的敦促下,伦敦皇家学会在2000年9月召开了一次专门会议,在更广泛的背景中来讨论这个主题。汉弥尔顿是资深专家,受人爱戴和尊敬,他的早期进化理论工作为爱德华·O·威尔逊(Edward O. Wilson)撰写《生物社会学》(Sociobiology)和理查德·道金斯(Richard Dawkins)撰写《自私的基因》(The Selfish Gene)提供了信息。他劝说皇家学会给OPV理论一个公平的评价。爱德华·霍珀,虽然他自己不是科学家,但也被邀请去发表演讲。希拉里·科普罗夫斯基也参加了,还有一些AIDS的主要研究者。但是,会议开办时,威廉·汉弥尔顿已经离世。
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他在2000年3月突然去世,在一次刚果研究之旅中感染了疟疾,因肠道出血而亡。在他缺席的情况下,他皇家学会的同事们讨论了大量的与HIV和AIDS起源有关的事情。OPV只是众多话题中的一个,但是它明显地推动着整个会议的议程。能否从分子生物学和流行病学中找到可用的数据,可以支持或反驳有关疫苗感染的设想?这个问题的一个必然推论是:HIV-1首次进入到人类是什么时候?如果最早的感染发生在1958年以前,那么那些感染就不可能是由科普罗夫斯基的OPV试验导致的。档案中提到的HIV阳性可能是有决定性的。
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在这种情况下才将DRC60从金沙萨大学带了出来。皇家学会会议之后,参会的一位比利时医生,迪尔克·特尤文(Dirk Teuwen),参与并重新收集了刚果早期的病理学参考资料,这些资料他在刚果殖民医学实验室里的存档报告中曾经见过。特尤文持有一种观点,他向其他与会者提到过,那就是HIV-1可能会在那些陈旧的石蜡块中封存的样本中检测出来。但他遭到了质疑。另外一些人怀疑道,任何有用病毒的痕迹不可能经过几十年的酷热、几十年简易的储藏方法、几十年政权动荡在革命之后仍能保存下来。但是特尤文很固执,他招募了助手。一位高级病毒学家,刚果人让–雅克·牧耶比(Jean-Jacques Muyembe),得到了卫生部的批准后,开始寻根探源。牧耶比去了金沙萨大学,在蓝帘子后的储藏室内仔细搜寻,将813石蜡封存的样本放在一只普通的手提箱里,随身带着,之后继续他的比利时专业之旅。在那里他将所发现的东西交给了迪尔克·特尤文。根据先前协作研究的协议,特尤文把它们送到图森市(Tucson)的迈克·伍罗贝那里。
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两条陈述线重叠在了一起。伍罗贝,作为一名研究生,既认识牛津的比尔·汉弥尔顿(Bill Hamilton),还认识比利时的一些疾病生物学家。出于对HIV起源的兴趣,伍罗贝陪汉弥尔顿一起到刚果进行最后那次致命的实地考察。他们是2000年1月去的,当时正处于刚果内战后的混乱时期。就是洛朗·卡比拉(Laurent Kabila)总统取代蒙博托·塞塞·塞科(Mobutu Sese Seko)的那次内战。汉弥尔顿想要收集野生黑猩猩的粪便和尿液样本;他希望那些样本可以帮助肯定或驳斥OPV理论。伍罗贝则对OPV理论不怎么看重,而是想记录HIV起源和进化的更多数据。当时刚果共和国正处于一种疯狂的阶段,比平时更为疯狂,因为两支反对洛朗·卡比拉的叛军部队仍旧控制着国家东半部的众多地区。汉弥尔顿和伍罗贝飞到基桑加尼(Kisangani,前斯坦利维尔),刚果河上游的一个地区首府,也是科普罗夫斯基开办疫苗公司的那座城市。当时该市河岸一边被卢旺达支持的军事力量所占领,另一边则被乌干达支持的力量所占领。由于战乱,商业航线不通航,所以两位生物学家与一个钻石商共同乘坐了一架小型包机。在基桑加尼,他们拜访了占领了多半个城市的由卢旺达支持的军队司令,然后很快到了森林中,在那里,虽然有豹和蛇,但会更安全。在当地向导的帮助下,他们花了一个月的时间,收集了野生黑猩猩的粪便和尿液。等他们要离开的时候,汉弥尔顿已经病了。
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他和伍罗贝都不知道是怎么得的病,但他们尽快赶了下一趟离境航班,到了卢旺达。从那里,他们再飞回乌干达的恩德培市,在当地汉弥尔顿被确诊为恶性疟疾并接受了一些治疗,然后又转到内罗毕,再从内罗毕到达伦敦希思罗机场。到那时,汉弥尔顿似乎度过了最糟的时期;他感觉好多了。他们完成了任务,且保全了性命。一位美国实地考察生物学家曾经向我表达过这样的时候是什么样的感觉。“这是事情的根本目标:把数据带回家。”那个人的研究也遭遇了很多危险——海难、饥饿、淹溺、蛇咬,虽然不是疟疾和枪击。“如果你经历太多的风险,就回不了家了,”他说,“如果你经历的风险极少,就得不到数据。”汉弥尔顿和伍罗贝获得了数据,回了国,但后来发现装有珍贵黑猩猩样本的冰藏箱在内罗毕到伦敦的途中行李转机时给弄丢了。
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我到图森市拜访了迈克·伍罗贝,想了解这个行程。“当时一切都还好,”他告诉我,“直到我们检查6个包,包括装样本的冷藏箱,才发现只有5个包出现在了行李传送带上,装样本的那个包不见了。”他的朋友汉弥尔顿第二天早上又病了,去了医院,出血非常严重,也许是因为他吃的防止疟疾高烧的消炎药所致。伍罗贝打电话过去,却从汉弥尔顿姐妹那里得到这样的消息:你是谁?打电话有事吗?比尔病危了。伍罗贝同时还要通过长途电话与内罗毕的行李管理者进行周旋,他们告诉他说冷藏箱已经找到,会随下趟航班到达。但到达的却是别人的冷藏箱,里面全是三明治。“那又是一出闹剧,而比尔却在医院快要不行了,”伍罗贝告诉我。他们的冷藏箱两天后才到达,而汉弥尔顿已经没有力气去庆祝了。他做了一系列的手术,输了血,挣扎几周之后,便去世了。
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汉弥尔顿为之付出生命的那些刚果黑猩猩粪便样本中,并未检出SIV呈阳性。那几份尿液样本在很边缘的区域可证明有抗体。结果也不够清晰或重要,不值得发布。好数据是在你寻找的地方发现的,但却不总是在你看过的地方出现。几年后,当金沙萨的人类病毒样本到达图森市时,即J·J·牧耶比用手提箱带到比利时的813小块石蜡包裹的组织,迈克·伍罗贝准备好了。他在这些样本当中发现了DRC60,真是让人意想不到。
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筛选石蜡包裹的陈旧器官样本块儿、寻找病毒RNA可不是件容易的事,即使对专家来说,也是一样。伍罗贝说,这些小块儿被证实是“一些最肮脏的组织,最不适合做分子生物学实验”。问题不是这些样本在室温下、在赤道上、在尘土飞扬的储藏室里储存了43年。问题是那些用于固定组织的化学物,1960年盛放甲醇和二甲苯的烧杯,这些卡波戈教授都曾给我看过。回到那个时期,病毒学家偏爱一种叫鲍音(Bouin)的固定剂,一种有效的含有少量福尔马林和苦味酸(picric acid)的混合剂。用它保存组织的细胞结构效果很好,像三文鱼肉冻一样,这时样本可以切成薄片,放在显微镜底下观察;但对有生命的长分子来说保存效果很差。这种混合剂易于把DNA和RNA分解成小段,伍罗贝解释道,然后形成新的化学键,留下“一种大团混乱的结构,而不是良好的珠串儿形式,那样便可以做分子生物实验”。因为过程费事,他只从金沙萨的813个组织块儿中筛选出了27个。就在这27块儿当中,他发现了含有RNA片段的组织块,确定无疑表明其为HIV-1。伍罗贝继续熟练地整理混乱的结构,并把RNA片段重新排列好,组成核苷酸碱基(nucleotide bases)序列之后将其命名为DRC60。
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这是需要用液体处理的工作。其他不需要液体处理的工作,主要由电脑完成,包括DRC60和ZR59代码的一一比对。也包括更广范围的比对,即将那两个病毒放在M组已知的HIV-1序列的家谱中进行比对。这样的对比旨在看看发生了多少进化性分歧。这些病毒株之间的差别有多大?突变积累起来的进化趋异现象是在代码层面的(其他也有,但在这里无关),在RNA病毒中,如HIV,突变率要相对快些。同样重要的是,HIV-1突变的平均速率是已知的,或者可以通过对许多病毒株的研究准确计算出来了。突变率被视为病毒的“分子钟”。每种病毒都有自己的速率,因此其分子钟测量着自身的变化速率。这样,两种病毒株之间的区别量就可以揭示出它们从同一种原分离后分开了多久。把分子钟作为考虑的因素,它们区别的程度就等同于消逝的时间。这就是分子生物学家如何计算他们称之为TMRCA这个重要参数的,TMRCA指的是距最近共同种原的时间。
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到目前为止一切顺利?你做得非常好。休息一会儿。现在一点点的理解就会推动我们跨过分子奥秘的深海湾,直达一个重要的科学发现。那么开始吧。
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迈克·伍罗贝发现从几乎同一年收集到的金沙萨人体样本中的DRC60和ZR59差别非常大。它们无疑都属于M组HIV-1;都不会与N级或O组混淆的,也不会同黑猩猩的SIVcpz病毒相混淆。但在M组内,它们之间差别很大。有多大?嗯,两者中有一部分的基因组差别率在12%。用时间衡量的话,是有多大的区别?伍罗贝算了算,大约50年。更精确地说,他将DRC60和ZR59最近共同种原追溯到1908年左右。
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这么说1908年HIV-1已经开始传播了?这比任何人猜测的都要早得多,所以这样的发现要登在权威期刊如《自然》上。在一个世纪后,发表于2008年的这篇文章中,列出了诸多合著者,包括J·J·牧耶比和让–马力·M·卡波戈。其中,伍罗贝写道:
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我们对分离时间的测定,对跨越几十年的进化时间表的测定,以及DRC60与ZR59之间巨大的基因差别的测定,都表明这些病毒都是进化自20世纪初期非洲人群种传播的一个共同种原。
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他对我说:“这并不是人类的新病毒。”
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伍罗贝的工作直接驳斥了OPV假设。如果早在1908年HIV-1就存在于人类,那么显然它不是1958年疫苗实验时感染给人类的。在这点上的澄清是非常有价值的,但这却只是伍罗贝的一部分贡献。以时间衡量重大疾病传播,代表着人们对理解AIDS如何开始及发展上迈出了一大步。
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以空间衡量疾病传播也同样重要,另一个实验室证实了这个结论。比阿特丽斯·哈恩(Beatrice Hahn)比伍罗贝年纪稍大,在伍罗贝发现DRC60很久以前,她就已经致力于研究AIDS的起源了。
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哈恩出生在德国,在慕尼黑获得了医学学位,然后于1982年到达美国,在罗伯特·加洛的实验室做了三年的博士后,学习逆转录病毒。接着她去了亚拉巴马大学伯明翰分校,在那里她成为医药学和微生物学教授以及AIDS研究中心联合主任,有一组聪明的博士后和研究生在她手下工作。(1985年至2011年她一直待在亚拉巴马,这段时期她做了这里所描述的大部分工作,然后她去了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医院。)哈恩做各类项目主要的目的,以及她与伍贝罗共同的目标,就是了解HIV-1的进化史及其近亲和祖先。对这类研究最合适的标签,就是在我请伍罗贝描述他的领域时用到的,即:分子种系遗传学。一位分子种系遗传学家仔细观察不同机体DNA或RNA中的核苷酸序列,再进行比较和对比;同理,分子种系遗传学家仔细研究灭绝的大蜥蜴骨骼化石块儿,以了解其种系和血统进化的过程。但对比阿特丽斯·哈恩医生,还有一个特别目的:检测HIV基因如何引发疾病,从而努力找到更好的治疗方法、预防措施,甚至找到治愈方法。
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过去二十年里,哈恩实验室发表了一些非常有意思的论文,其中许多是将初级研究者署名为第一作者,导师哈恩却列在最后。1999年时,高峰发表了一篇关于SIVcpz的种系遗传及其与HIV-1关系的研究。当时只有三种已知的SIVcpz,都从被圈养的黑猩猩身上提取出来的,而高峰的文章中提及的SIVcpz被列为第四种。该作品发表在《自然》上,被高度评价为“关于HIV-1从黑猩猩(Pan troglodytes)传播到人类最具说服力的证据”。事实上,高峰和他的同事不只是在黑猩猩上追溯到了HIV-1;他们对病毒株的分析还与特定的一种中非地区的亚种黑猩猩(Pan troglodytes troglodytes)联系了起来,它们的SIV发展成了HIV-1M组。这种亚种黑猩猩只生活在中非的西部,刚果河北边,乌班吉西边。所以高峰的研究有效地识别出了AIDS起源的宿主和地理区域。这是个重大发现,《自然》的评论标题这样描述:从黑猩猩到疫情。当时高峰是哈恩实验室的一名博士后。
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但是因为高峰在病毒上的基因对比(就如玛蒂娜·皮特斯早时所做的)是基于从被关押被圈养的黑猩猩身上取样得到的,所以野生黑猩猩间的传染还是有些许不确定性的,至少再过了几年才能确定。后来在2002年,马里奥·L·桑提亚戈(Mario L. Santiago)带领一队合著者在《科学》上宣布他们在野外发现了SIVcpz。桑提亚戈是比阿特丽斯·哈恩的一个博士学生。
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桑提亚戈工作中最具意义的方面,就是在检测一个野生黑猩猩(被检测的58只中只有一只携带)的SIV时,他发明了可以实施这种检测的方法,正因此他的博士学位实至名归。这种方法是“非侵入式的”,意味着研究者不需要抓住黑猩猩、抽它的血。研究者只需要在森林里跟随这些动物(更省事儿的是,派一个实地考察助理去接那黄色液体),当它们撒尿时,用小试管直接取样本,然后从样本中筛选抗体。结果证明尿液几乎和血液的显著性相同,一样能说明问题。
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“这是个突破,”哈恩在她伯明翰实验室的一次谈话中告诉我,“我们不太确定这是否行得通。”但桑提亚戈冒险完善了技术,而且确实发挥了效用。野生黑猩猩的第一个SIV阳性尿液样本来自世界上最著名的黑猩猩群:坦桑尼亚贡贝国家公园的一个群体,早在1960年珍妮·古道尔(Jane Goodall)就在这里开始了她的历史性实地考察。这样本与HIV-1的接近程度并没有高峰的实验结果那么接近,而且它来自于另一个独立亚种,东部黑猩猩,施氏黑猩猩。但是,它确实是SIVcpz。
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哈恩告诉我,在贡贝取样的优势是那些黑猩猩不会跑开。它们是真正野生的,但在被古道尔和她的后继者们研究了40年后,已经习惯了人类的存在。如果是别处的话,尿液筛选法就不能实施了。“因为,你知道,不习惯人类的黑猩猩不会离你特别近,你也就无法接到它们的尿液。”当然,你可以在森林地面上收集它们的粪便,但如果没有保存良好,排泄物样本就无用了;新鲜粪便含有充足的蛋白酶和消化酶,而这些蛋白酶和消化酶会在你拿到实验室之前就毁灭了病毒。这些就是分子生物学家研究野外动物的一些局限性,即:血、屎和尿的相对可得性和其他参数。
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