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本实验采用躲避条件反射建成后的不同时间,大鼠血清内乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的变化情况,看看它与学习记忆有何关系。
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【理论基础】
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许多研究表明,在学习过程中神经网络中发生的突触可塑性变化,无论是突触传递易化或是突触阻抑都是因为改变了神经递质的释放或利用率。乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)是与学习记忆关系密切的一种神经递质,有研究表明脑内Ach和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)比率较高的大鼠品系,其学习能力强一些;相反,Ach和AchE比率比较低的大鼠,其学习迷津的能力就较差。老年人记忆力衰退与胆碱能系统功能密切相关。与青年人相比,老年人脑内胆碱乙酰化酶(CAT)的活力降低,而胆碱酯酶的活力升高。
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本实验利用乙酰胆碱酯酶能使乙酰胆碱水解,而未被水解的剩余乙酰胆碱可与碱性羟胺作用,生成乙酰羟胺,后者在酸性溶液中与铁离子作用形成棕色复合物,可用比色法加以测定,计算剩余Ach含量,从而推算出胆碱酯酶活力。其反应式如下:
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【实验对象】
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成年大鼠4只。
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【实验用品】
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条件反射箱,721分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。
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(1)乙酰胆碱基质缓冲液:
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A液:巴比妥钠1.03g,蒸馏水30mL,1mol/L盐酸6mL,碳酸钠0.53g,加热助溶,然后加生理盐水至50mL。
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B液:氯化乙酰胆碱910mg,或溴化乙酰胆碱1.13g,加生理盐水至10mL(注意:氯化乙酰胆碱在一般水溶液中易水解失效,因此必须在临用前配制,或以5%的NaH2PO4溶液配成0.1%左右的氯化乙酰胆碱贮存液,配好后用瓶装密封放入冰箱中贮存,药效可保持一年,临用前用生理盐水稀释至所需浓度。)
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C液:氯化镁0.42g,氯化钾20mg,生理盐水加至10mL。
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(2)碱性羟胺溶液:14%盐酸羟胺与14%氢氧化钠溶液按1∶1比例混合。
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(3)氯化铁溶液:氯化铁(FeCl3·6H2O)10g,以0.02mol/L盐酸溶解并加至1000mL。
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以上溶液事先都由教师配制好,实验前学生只需准确量取A液16mL,B液2mL,C液2mL混合即可。
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【实验内容】
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1.躲避条件反射的建立
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选成年大鼠4只,2只为对照组,2只为实验组。实验组动物需进行躲避条件反射训练,采用条件反射箱进行,该箱用塑料板隔成两小间(一间明室,一间暗室),隔板底部中间有一小门相通,暗室的底部装有电栅地板可通电。
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实验时将动物放入明室内,任其在箱内探寻,用秒表测定动物从明室通过隔板上的小门进入暗室的时间(即潜伏期),让动物在暗室内呆10s后放回鼠笼。如此反复三次,每次间隔3min,计算三次潜伏期的平均值。
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第4次实验时,记录潜伏期。当动物进入暗室后,立即关闭小门,给予电击(电压70V,电流1mA),电击时间5s。5min后进行第5次实验,方法同第4次实验,直至动物在明室内呆上4min不再进入暗室才算完成(本实验最多电击10次,计算电击后的潜伏期是否比电击前有所增加),此时将动物立即断头处死。
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对照组动物只在实验箱内呆上同样的时间,不给与电击,然后断头处死。
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2.乙酰胆碱酯酶样本的制备
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行为训练结束后,立即断头处死动物取血,放置1小时后离心(1500r/min)15min,取上层清液。
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