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内科学新进展 第五节 细胞移植治疗充血性心力衰竭进展
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摘 要 充血性心力衰竭（CHF）发病率逐年升高，已成为威胁公众健康的一大问题。近年来大量基础和临床研究提示，干细胞移植是一种崭新的治疗方法，骨髓基质干细胞（MSC）具有良好的分化潜能，能分化为心肌样细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，从而再生心肌和血管，延缓心肌重塑，改善心肌收缩功能和室壁顺应性，促进血管再生，建立有效冠脉侧支循环，提高心脏整体功能，既改善了血供又解决心肌细胞数量减少这一心力衰竭的根本原因；而且自体移植不受来源限制，取材方便、创伤小，也不存在免疫排斥和基因突变等安全性问题，因此作为充血性心力衰竭治疗的新途径有着广阔的前景。现就近年来国内外MSC自体移植在治疗CHF方面的研究进展作一综述。
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Abstract The incidence rate of congestive heart failure is annually increasing, which is threaten for the public health. In the recent years a large number of basic and clinical studies showed that stem cell transplantation was a new treatment. The bone marrow-induced mesenchymal stem cells（MSCs）have multi-potent to differentiate into cardiomyocytes andvascular endothelial cells. And smooth muscle cells, which contributes to myocardium regeneration, revascularization, and ventricular remodeling with the improvement of cardiac function and compliance. Withmore, MSCs transplantation promotes neoangiogensis, establishes coronary collaterals, improves global cardiac function and attenuates cardiomyocytes less, thus retard heart failure. Autologous MSCs transplantio transplantation is unlimited, available, easy taken, noninvasive, without no immune rejection, gene mutation or other safety problems. It is a new way to treat congestive heart failure with autologous MSC transplantation and with bright prospects. In this review, the development of autologous MSC transplantation in the treatment of congestive heart failure is in troduced as follows.
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一、前 言
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充血性心力衰竭是一个严重的全球性公众健康的问题，有着很高的致残率和致死率。据世界卫生组织统计，目前充血性心力衰竭发病率逐年升高，平均约2％，65岁以上达到6.4％，其发病率每十年增加一倍，因此在发达国家及一些疾病谱正向发达国家靠拢的发展中国家（包括中国），充血性心力衰竭已成为卫生健康工作者面临的主要问题之一。常见病因为冠状动脉粥样硬化性心脏病心肌梗死、未控制达标的高血压病、原发性扩张型心脏病等。当各种因素作用于心肌细胞引起不可逆损伤后，心肌细胞死亡，纤维组织形成，左室重构，最终导致心力衰竭。目前治疗充血性心力衰竭的方法主要有药物治疗、心脏再同步化治疗和心脏移植等。心脏移植近期效果满意，但受到供体来源少、创伤大、远期移植心冠脉粥样病变、排斥等因素的制约。近年来大量基础和临床研究提示，干细胞移植是种崭新的治疗方法，胚胎或者成体干细胞在梗死的心脏中可以分化成心肌细胞，参与新生血管形成，恢复心功能，显示出良好应用前景。干细胞的“干”译自英文 “Stem”，意为“树”、“干”和“起源”。顾名思义，干细胞即起源细胞。干细胞研究已成为生命科学中最活跃的研究领域之一。干细胞特性包括可无限自我复制和可分化为组成器官的多种细胞。根据分化能力可将干细胞分为多能干细胞和单能干细胞。多能干细胞可分化为任一种细胞，如胚胎干细胞。而单能干细胞只能沿一个细胞系分化，如造血干细胞。按照来源又可将干细胞分为胚胎干细胞、躯体多能干细胞（多数起源于骨髓，在脐血中也有发现）、躯体组织祖细胞（如卫星细胞、成肌细胞）。骨髓细胞表现出显著的异质性，含有骨髓造血干细胞、间充质干细胞和各种组织的祖细胞。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种多能干细胞，具多向分化的潜能，同时又具有获取方便、扩增能力强、免疫原性低、不受伦理学限制等优点，故而成为近年来细胞治疗和细胞工程的首选种子细胞。
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MSCs又称为髓基质细胞或间充质祖细胞，于1966年首次被Friedenstein发现，他从骨髓中分离出成纤维样形态的细胞，称之为骨、软骨祖细胞。它能分化成不同的间充质组织细胞如骨、软骨、脂肪、腱和肌肉组织。另外，MSCs还能分化成一些其他类型组织细胞，如肝、肾、血管内皮细胞、心肌和神经细胞。
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二、动物实验
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Koh等首先将心房肿瘤（AT1）心肌细胞成功移植入宿主心肌并发现其对宿主心功能无损害。Reinecke等将胚胎、乳鼠及成年大鼠心肌细胞移植入正常心肌、急性冷冻损伤心肌以及肉芽组织（损伤后6d），发现成年大鼠心肌细胞在任何情况下都未存活，而胚胎与乳鼠心肌细胞则能形成成熟的心肌组织并能与宿主心肌耦合。Tomita等采用鼠冻伤心肌模型进行自体MSC移植，以BrdU作标记，移植后5周在移植区域组织切片中检测到BrdU染色阳性细胞且其肌钙蛋白T染色阳性，证实自体移植的5-氮胞苷诱导的MSC转化为心肌样细胞，并改善梗死心肌的功能；2002年他们还观察了自体MSC移植对大动物的心肌再生作用，结果提示移植细胞可形成岛样心肌细胞，促进血管新生，防止左室重塑，提高局部及全心的收缩功能。
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Tang等采用结扎左前降支的方法制作大鼠MI模型，1周后将体外扩增的自体MSCs用DAPI标记后多点注射至心肌梗死区及其周围，结果表明，在移植区域组织切片中能检测出DAPI标记的植入细胞，移植后第1、2及4周，MI区移植细胞逐渐分化成心肌细胞和平滑肌细胞，免疫荧光分析表明MSCs表达cTnT，说明一小部分MSCs分化成了心肌样细胞；半定量分析表明MSCs移植组毛细胞血管密度明显增加，而且4周后血流动力学表明MSCs移植组心功能明显改善，半定量组织形态学检查表明MI区域面积显著减小，左室壁厚度较对照组为厚，左室心腔扩张指数较低；超声心动图、心导管检查也均证实了MI后MSC移植能改善心功能。该研究说明，MSCs移植能够通过血管重建和心肌再生改善心脏结构和功能。
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我们对新西兰大白兔大鼠等心梗模型中的研究表明，将同种异体骨髓间充质干细胞直接注射移植入心肌梗死区域能改善心肌梗死后的心脏功能。新西兰白兔分为3组。其中实验组制成MI模型后即刻在MI局部区域注射1×107个/ml的同种异体MSCs悬液，共0.3ml；模型组制成MI模型后在MI局部区域注射0.3ml磷酸缓冲液（PBS)；假手术组冠状动脉下穿线而不结扎，对应实验组MSCs移植部位注射0.3ml PBS。MSCs移植前用BrdUrd体外标记。4周后发现实验组死亡率16.7％（2/12）显著低于模型组35％（7/20）（P＜0.05）。存活4周动物中，实验组术后LVIDd、LVIDs为1.17±0.21cm、0.74±0.13cm，显著小于模型组1.64±0.14cm、1.19±0.12cm（P＜0.05）；实验组术后LVEF为（63±6）％，显著大于模型组（53±6）％（P＜0.05）。实验组存活4周的10例动物中，8例（80％）发现移植细胞存活于非MI区、MI区及其周边，并部分转化成心肌样细胞；7例（70％）移植细胞参与构成MI区域血管组织。
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也有些研究发现MSCs移植只是短期改善心功能，并无长期稳定效果，只能提高局部心肌收缩功能和改善心室重构。出现这种情况可能是由于短期心功能受益来源于MSCs的旁分泌作用，很少MSCs分化成真正意义上的心肌细胞。还有一个重要原因就是移植的MSCs在宿主心肌微环境中存活率很低。MSCs移植在一个极度恶劣的微环境中，缺乏血液供应、低氧浓度、组织损伤触发炎性反应以及产生氧化应激反应和细胞毒性物质等都可能导致移植细胞的死亡，其中之一是通过凋亡的机制。MSCs移植后生存率低大大限制了细胞治疗的效果，因此保护移植的MSCs，提高其在宿主中的存活率是细胞治疗成功的关键。目前提高MSCs存活的方法主要有两种：一是基因修饰MSCs，二是用有利于生存的细胞因子或其他物质预处理MSCs。Chang等发现活化的Akt/PKB能够作用于下游关键的凋亡蛋白如Bcl-2家族成员的促凋亡因子Bad，使之失活，起到抗凋亡的作用。Li等在MSCs中转染抗凋亡基因Bcl-2，减少了32％的细胞凋亡和增加了60％的VEGF分泌。体内移植后，转染了Bcl-2的MSCs存活率也明显增加。Song等转染基因进入MSCs，使MSCs表达组织转谷氨酰胺酶增高，继而增高细胞的黏附，最终提高移植后细胞的生存。肾上腺髓质素（adrenomedulin, AM）能通过PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡，分别用MSCs和AM或者两者联合经静脉输入到大脑中动脉阻塞2h的大鼠中，发现MSCs和AM联合治疗组效果最好，AM能提高MSCs的治疗潜力，可能是通过抑制移植的MSCs的凋亡和诱导血管形成。聚胺是哺乳动物细胞生存和生长有力的调节剂，Muscari等研究检测显示聚胺耗损能是一种对抗MSCs凋亡有用的手段。还有研究显示用洛伐他汀处理MSCs能激活PI3K/Akt和ERK1/2通路，显著地抑制缺氧与缺血清诱导的MSCs凋亡。
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我们先前的研究发现缺氧预处理可降低缺氧缺血清诱导的MSCs凋亡，增强MSCs对心肌细胞的保护作用。MSCs表面表达Heregulin和ErbB受体，且Heregulin对无血清和缺氧诱导的MSCs凋亡具有保护作用，从而促使其对心肌细胞的保护作用。用环胞霉素A预处理的MSCs可通过线粒体途径抗细胞凋亡，增强移植后细胞的存活率。MSCs的抗凋亡作用可能与电压依赖性的通道相关，因而K+通道阻滞剂能有效降低MSCs移植后的凋亡率。
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三、临床应用
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目前临床研究中使用的细胞主要为自体骨髓干细胞和骨骼肌成肌细胞。报道细胞移植所采用的途径主要为经冠状动脉注入、开胸手术时注射入心外膜下、经导管注射入心内膜下三种。
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Strauer等用PTCA球囊将自体骨髓单核细胞植入梗死相关动脉，随访3个月后发现10例接受BMC移植的患者梗死区显著小于接受标准治疗的急性心肌梗死患者（P=0.04)，每搏输出量、左室收缩末期容积、收缩能力、梗死区心肌灌注显著改善。
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REPAIR-AMI（reinfusion of enriched progenitor cells and infarcted remodeling in acute myocardial infarction）是第一个分析AMI后早期冠状动脉内移植骨髓祖细胞治疗效果的随机双盲安慰剂对照多中心研究，共入选204例患者，患者接受移植的时间平均为心肌梗死后4天，经冠状动脉内注射骨髓干细胞（约2×108）或是无细胞的上清液。随访4月时LVEF的绝对增加值在细胞移植组为（5.5±7.3）％对照组为（3.0±6.5）％，P=0.01。亚组分析表明基线LVEF在平均值或以下的患者（≤48.9％）获益最大，特别在开始治疗迟的患者（AMI后5d）LVEF增加更显著（7.0％比1.9％）。治疗组中，改善原因部分与收缩末容积缩小有关，而舒张末容积无改变。随访1年时细胞移植组临床终点事件（死亡、心肌梗死再发、血运重建）显著低于对照组（P=0.01）。研究提示冠状动脉内骨髓干细胞移植对急性心肌梗死患者来说是安全可行的策略，可促进新近梗死心肌的功能再生。
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MAGIC Cell-3-DES试验（myocardial regeneration and angiogenesis in myocardial infarction with G-CSF and intra-coronary stem cell infusion-3-drug eluting stents trial）评价基于G-CSF动员的干细胞疗法的安全性和比较冠状动脉内注射动员的外周血干细胞对AMI和陈旧性心肌梗死（OMI）的效果。96例心肌梗死患者用药物涂层支架血运重建后随即分为4组，其中82例完成了6个月随访。细胞移植组用G-CSF 3d动员外周血干细胞并收集，再经冠状动脉内注射移植。与对照组相比，AMI细胞移植组LVEF显著增加、重构改善〔LVEF改变：（+5.1±9.1）％比（-0.2±8.6）％，P＜0.05；收缩末期容积改变（-5.4±17.0）mL比6.5±21.9mL，P＜0.05〕。OMI患者LVEF和左室重构无明显改善，但冠状动脉血流储备显著增加。用药物涂层支架后基于G-CSF的干细胞治疗并不促进内膜增生。
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BOOST试验是心肌梗死后经冠状动脉移植自体骨髓细胞的随机对照研究。患者入选标准：急性ST段抬高性心肌梗死（5天内）成功行PCI。细胞移植时间：PCI后4.8±1.3d。主要终点：6、18月后的LVEF改变（MRI检查）。结果发现6月时细胞移植组LVEF增加显著高于对照组（6.7％比0.7％），但18个月时两组间差异无统计学意义（5.9％比3.1％）。研究提示单次冠状动脉内注射BMCs可加速AMI后LVEF恢复。那么这种LVEF的加速恢复能否给患者带来更多的临床益处值得我们认真考虑和进一步研究。
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TOPCARE-CHD试验（transplantation of progenitor cells and recovery of LV function in patients with chronic ischemic heart disease trial）为随机对照交叉设计，共入选75例稳定的缺血性心脏病患者（心肌梗死至少3个月以上）。向供应左心室运动最差区域的冠状动脉内输注外周血祖细胞（24例）、骨髓祖细胞（28例），对照组不输注细胞（23例）。随访3个月后，对照组患者随机分为接受外周血祖细胞或骨髓祖细胞输注，研究初始接收外周血祖细胞或骨髓祖细胞移植的患者分别交叉到接受骨髓祖细胞或外周血祖细胞输注。结果发现移植骨髓祖细胞患者的LVEF改变绝对值（+2.9％）要显著高于输注外周血祖细胞（-0.4％，P=0.003）或不输注细胞的患者（-1.2％，P＜0.001）。心脏收缩功能的增加与冠状动脉内输注骨髓祖细胞区域心肌收缩显著增强有关。研究的交叉相分析显示无论患者是从对照交叉到骨髓祖细胞还是从外周血祖细胞交叉到骨髓祖细胞，冠状动脉内输注骨髓祖细胞后左心室整体和局部收缩功能均显著改善。研究提示对于OMI心肌已经愈合的患者冠状动脉内输注祖细胞是安全可行的，骨髓祖细胞移植3月后LVEF有轻度但是统计学显著意义的升高。
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我们自己的研究也发现自体骨髓间充质细胞移植对OMI患者也是安全有效的，22例陈旧性心肌梗死伴心功能不全患者随机分为对照组和移植组各11例，在常规药物治疗的基础上，经冠状动脉内注射自身骨髓间质干细胞或等量生理盐水。术后3个月和6个月，与对照组比较，细胞移植组BNP降低，6min步行试验距离增加，与自身术前比较差异亦具显著性。术后3个月，细胞移植组LVEF增加，与对照组和自身术前比较差异有显著性（0.40±0.03比0.37±0.09，0.35±0.05，P＜0.05）。术后6月，细胞移植组左室舒张末容积缩小，与对照组和自身术前比较差异有显著性。双核素心肌显像提示移植组术后6个月灌流—代谢不匹配节段数增加，与对照组和自身术前比较差异具显著性（7.60±1.26比6.20±1.14，5.80±1.69，P＜0.05）。围手术期及术后6个月随访中未见任何严重心律失常发生。对于原发性扩张型心肌病，MSCs移植虽然不改变LVEF，但能改善6min步行试验，降低BNP的增高，改善心功能不全。
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四、结 论
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目前提高MSCs存活的方法主要有转染促存活基因以及用细胞因子和其他物质处理MSCs等，取得一定的效果。但用病毒转染时有免疫原性及毒性作用，可能会限制在临床上的使用，所以需要寻找一种更安全有效的转染方法。另外转染的基因高表达也会带来一定的风险。而用细胞因子和其他物质处理MSCs仍处于体外细胞的研究阶段，其疗效还需要大量的体内动物实验以及大规模、多中心、双盲、对照临床研究来证实。ASTAMI（autologous stem cell transplantation in acute myocardial infarction）研究发现细胞移植前后 CK、CK-MB无明显改变。REPAIR-AMI研究发现随访4个月时细胞移植组LVEF增加更多，1年时临床事件（包括死亡、心肌梗死再发、血运重建）更少；细胞移植组和对照组均有2例死亡，对照组6例再发心肌梗死，血运重建更多（28
:19）。关于再狭窄，MAGIC Cell-3-DES试验已证实在药物涂层支架基础上干细胞治疗并不增加再狭窄。因此从目前的证据看，缺血性心脏病的干细胞治疗是安全有效并且切实可行的。未来应该进行更大样本（每组几百例）、更长时间（3～5年）的大规模随机对照多中心研究来进一步评价它的效果和风险。同时基础和临床研究应该齐头并进，明确哪种细胞能够真正有效改善心功能、细胞移植的效果能持续多久、如何安全有效地提高移植后MSCs存活率、重复移植是否带来更大的益处等。
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【思考题】
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1．细胞移植治疗充血性心力衰竭的可能机理如何？
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2．目前用于临床治疗充血性心力衰竭的移植细胞有哪些？有哪些证据支持？
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