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若要追溯这幅布克哈特口中的“令人不休不眠的杰作”的制作过程，我们首先需要看温莎城堡皇家图书馆收藏的一页笔记，这页笔记上有一幅墨水笔画的早期构图草图。 85 草图表现的仍是传统的“最后的晚餐”肖像画——犹大没有与众人坐在一起，他背对着我们，坐在桌子靠近前景的一侧，而圣约翰在基督身旁睡着了，指的是当耶稣宣布遭到背叛的消息时，他正“侧身挨近耶稣的怀里”。画作最后的版本放弃了这两个人物。
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这页笔记上有两幅分开的素描。左手边的草图中有10个人物，这页纸可能被裁剪过，所以少了3个人。在这些人身后，淡淡地画着几扇拱门——这让我们首先想到这幅画的背景，即这顿晚餐的地点马可楼。右手边的草图描绘了4个人物，但基本上是基督和犹大的素描。列奥纳多在此集中表现了确认背叛者身份的戏剧化瞬间：“耶稣回答说，同我蘸手在盘子里的，就是他要卖我。”（《马太福音》26∶23）犹大从他的凳子上站起来，正把手伸向盘子。素描画了两种基督的手的姿势——一种是手抬起来好像要伸向前方，另一种是手已经摸到盘子，在与他的背叛者的手接触时有所迟疑。这幅较小的速写使故事焦点更加集中，找到了戏剧性的支点，即二人的手若有似无地相触的一刻。为了聚焦于这一刻，列奥纳多已经将故事从更传统的描绘圣餐仪式的“最后的晚餐”向前移了几帧。
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《最后的晚餐》习作。上：温莎城堡皇家图书馆收藏的早期构图素描。下：犹大的头部（左）和大雅各的习作。
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这幅较小的素描的另一个组成部分是睡着的圣约翰，耶稣把手臂搭在他的背上。这是圣经中的温柔音符——约翰是“耶稣所爱的”门徒——但在某些无宗教信仰的怀疑论者眼中，约翰“侧身挨近耶稣的怀里”是同性恋的表现。100年后，克里斯托夫·马洛曾发表渎神言论称，基督对约翰怀有一种“超乎正常的爱”，并“把他当作索多玛① 的罪人”。人们还记得萨尔塔雷利绯闻，这个事件的潜台词是，官方不赞同让具有女性气质的年轻男子当天使和少年基督的模特。列奥纳多最后在作品中把他俩分开了，但约翰仍是所有门徒中最年轻俊美的。
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不久之后，列奥纳多绘制了一幅红色粉笔素描，现存于威尼斯学院美术馆，这幅素描或许又被其他人用墨水重新描了一遍。 86 素描看起来很粗糙，主要是因为墨水，但《最后的晚餐》的构图已经初见端倪：门徒被分成几组，个人特征得到了更多的强调，人物下方有匆匆写下的文字以说明身份（腓力被提到两次）。但犹大仍位于桌子靠近我们的一侧，约翰也仍在昏睡。
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这些素描让我们得以窥视列奥纳多的早期构想：他快速、专注地画好这些微型蓝图，在过程中不断问自己：画成这样还是那样？但正如在列奥纳多身上经常发生的那样，这幅画有着更深的根源，虽然这些速写是第一批为感恩修道院的《最后的晚餐》实际绘制的草稿，但我们在他的素描本中发现了一张更早的草图，时间可追溯到15 世纪80 年代左右，上面画着3幅相互关联的素描：一群人坐在桌旁，一个人双手托着自己的脑袋，还有一个人毫无疑问是基督，他的手指指着那预示着灾难的盘子。 87 这些素描并非为《最后的晚餐》创作的草稿：那一群人不是门徒，只是5个坐在桌子前的男人，闲聊着打发时间。我们可以猜测，画中的场景可能是村里的某次节日活动，人们围坐在用支架支撑的桌子前。但列奥纳多被激发了灵感，所以他在同一张纸上快速画下了一幅举行圣餐仪式的基督的素描，15年后，这个灵感终于在米兰的伟大壁画中开花结果。
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温莎城堡皇家图书馆和威尼斯学院收藏的素描，重点逐渐从整体布局转移到个体人物的特征上，所以我们得以在温莎城堡皇家图书馆收藏中看到著名的头像系列，这些头像大多以红色粉笔画成，有些完成度很高。这些人物终于从迷雾中显现出来：犹大、彼得、大雅各、圣腓力（几乎可以肯定，后两个角色使用了同一名模特，尽管在画中他们各有不同）。在这些素描中，还有一幅精美的圣约翰的手部特写，以及一幅圣彼得衣袖的速写。 88 《福斯特古抄本》对这些素描的简短评述补充了它们的相关信息：来自帕尔马的亚历山大是耶稣的手部模特；“住在比塔的克里斯托法诺·达·卡斯蒂廖内，头部很美”。有一则笔记的标题简单地写着“耶稣”，列奥纳多在下面写着“乔瓦尼·孔蒂, 与摩塔洛枢机主教一起的那位”，这可能告诉了我们基督的模特的名字。据消息灵通的阿拉贡的路易吉说，他在1517年看到了这幅画，并说画中有些门徒是“米兰的廷臣和重要市民的真实肖像”。 89
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在一则著名的笔记中，列奥纳多列举了一些门徒的反应：
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有一个人正在喝酒，将酒杯放回原位，将头转向说话的人。
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另一位将手指拧在一起，表情严肃地转向他的同伴，他将手掌摊开，肩耸到耳朵，惊讶地张大了嘴……
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另一个人转过身，手里握着刀，碰倒了桌上的一个玻璃杯……
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另一人身子向前倾，看着说话的人，用手遮住了双眼。 90
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其中一些人物在最终的画作中得到了表现——白胡子的圣安德烈（左起第三个人）摊开了手掌并耸着肩膀。其他人则有所变化，手中握着刀转身的（圣彼得）与碰倒玻璃杯的人分成了两个人，后者成了打翻盐罐的人（犹大）。这些姿态至少有一种已经出现在温莎城堡皇家图书馆收藏的第一幅构图速写中：在人数较少的那群人中，那个位于基督和犹大之间的人“用手遮住了双眼”。
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与构图规划一样，情感的动态也体现了列奥纳多创作《最后的晚餐》时的全新观念，他打破了中世纪继承下来的传统，即门徒们僵硬地在桌子前坐成一排。在佛罗伦萨，他可能已经见过塔代奥·加迪、安德烈亚·德尔·卡斯塔尼奥、安吉利科修士和多梅尼科·吉兰达约版本的《最后的晚餐》。 91 吉兰达约的《最后的晚餐》优雅得近乎呆滞，壁画位于万圣教堂的食堂，是在列奥纳多前往米兰前不久完成的。在列奥纳多的版本中，用餐者排成一行的方式被神奇地打断了，取而代之的是，我们看到一群人组成了波浪形，彼得罗·马拉尼将之比作《巴黎手稿C》中的光学图示。 92 波浪被分为4组，每组有3名门徒：这些三五成群的人突然陷入危机时刻。列奥纳多也找到了他的戏剧化时刻——不是圣餐仪式，也不是确认犹大的身份，而是基督宣布消息时众人因震惊而动弹不得：“正吃的时候，耶稣说，我实在告诉你们，你们中间有一个人要卖我了。他们就甚忧愁。”（《马太福音》26:21—2）因此，在一定程度上，构图所具有的新颖的流动性是一个几乎电影化的叙事选择——选择描绘讲出真相的那一刻——所带来的。这幅壁画最早一批的评论者之一卢卡·帕乔利很好地描述了这一点。他在写于1498年12月14日的《神圣的比例》的献词中写道：
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人们很难想象比众门徒听到真理之声道出“你们中间有一个人要卖我了”时的表情更为专注的样子了。通过他们的行为和姿态，他们似乎在相互交谈，一个人和另一个人，而那个人又和另一个人，他们都充满着强烈的好奇心。我们的列奥纳多用他的一双巧手创造了这一切，相当可敬。 93
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帕乔利的描述很有趣，因为他那时与列奥纳多关系很亲近，因此这段评论可能也反映了列奥纳多自己关于“专注”和“好奇”的陈述——这二者使得对基督的关注以及使徒之间的互动感变得异常激烈。这幅画就达到了这样的效果：人物不是排成一列，而是相互交错，“一个人和另一个人，而那个人又和另一个人”交谈。
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然后是犹大，他是这幅画中的反派。温莎城堡皇家图书馆收藏的一幅准备性侧面速写，画的是一个与其说邪恶不如说丑陋的男人，几乎是一个丑八怪，但他带着一丝懊悔和自我厌恶，使这幅侧脸画带着悲剧色彩，或实际上是基督的宽恕。（最近的修复工作使《最后的晚餐》恢复了每个人面部的微妙细节，这些细节原本在后来的修饰中丢失了；犹大就是一个例子，他的脸现在比修复前更加接近准备性侧面速写的样子。）即使他的手原本已伸向要浸入盘子里的面包，但在听到基督的话后，又缩了回去。
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关于列奥纳多《最后的晚餐》中犹大的脸，瓦萨里曾说过一段著名的逸事：感恩修道院的院长总是不断催促列奥纳多“快点完成作品”，并向公爵抱怨这位艺术家总是拖延时间。列奥纳多回应卢多维科说，他还在寻找一位长得极为邪恶狠毒的人作为犹大的原型，但如果他找不到合适的人选，“他完全可以用那位不机灵、缺乏耐心的院长”当模特。这番话逗得公爵大笑不止，而“那位不幸的院长一脸困惑，担心在他花园中干活的工人去了”。这是瓦萨里众多能被证明具有一定的真实性的趣闻中的一条，或至少当时有人目睹了这一幕。这则故事是从1554年出版的詹巴蒂斯塔·吉拉尔迪·钦提奥的《关于小说创作的演讲》中抄来的，而钦提奥则是从他的父亲克里斯托福罗·吉拉尔迪那里听来的，后者是费拉拉的外交大使，在米兰时与列奥纳多有私交。吉拉尔迪版的故事声称记录了列奥纳多自己的话：
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我还要画犹大的头部，你们都知道，他就是那个大叛徒，因此他的脸应该表现出他所有的邪恶……因此，一年来，我每天早晚都去博尔盖托，所有卑微又卑贱的人都住在那里，他们大多数人邪恶堕落，我希望在那里可以找到一张符合这个邪恶角色的脸。直到如今我都没能找到……如果我最后找不到合适的，就不得不用这位神父、修道院院长的脸了。 94
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不管这个故事是真是假，我们现在都离列奥纳多的真实记录不远了。这就是认识他的克里斯托福罗·吉拉尔迪记忆中或想象中的列奥纳多说的话：“因此，一年来，我每天早晚都去博尔盖托……”
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《最后的晚餐》的绘制始于在修道院食堂的墙上均匀地涂抹上一层灰泥，这构成了壁画的底层结构。 95 中间部分的灰泥层——也就是画面展示主要情节的地方——比较粗糙，为其上的涂料层提供了更好的黏着力：我们可以看到，两个部分之间的连接处有一条模糊的水平线，靠近用透视法描绘的天花板的中间位置。人们在最近一次修复工作中发现，勾勒《最后的晚餐》轮廓的画稿是直接在灰泥上完成的——“极简的红线，徒手画成，笔触流畅……为他的构图界定了图块”。完成这一步后，再涂上石膏底料：现代分析显示，这层石膏底料是“一种微颗粒混合物，100微米至200微米厚，由蛋白质黏合剂将碳酸钙与镁黏合而成”，在这之上是一层薄薄的铅白。在这个阶段，列奥纳多在表面留下一些切口，主要是为了确定建筑背景的形式和视角，他还在画区的中心打了一个小洞，作为整幅画的灭点，这体现了他对精确性的可怕的追求。这个洞可以在放大的照片中看到，就在基督的右太阳穴上。
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所有这些准备工作提醒着我们，这是一项工作室成员的集体作业（班代洛在记述中遗漏了这一点，使人误认为它是由这位艺术家单独创作的）。据说米开朗琪罗独自创作了西斯廷教堂壁画，列奥纳多不是这样工作的，他有一个助手团队：可能包括马可·德奥焦诺，他绘制了《最后的晚餐》最早一批临摹本之一；萨莱，当时大概16岁了，作为列奥纳多的仆人工作；托马索·马西尼，有文献显示他后来参与绘制了一幅大型壁画（佛罗伦萨的《安吉亚里战役》壁画）。除了这些他信任的助手，他可能还新收了学徒和助手，他们的名字能在《大西洋古抄本》的两页笔记中找到： 96
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约蒂提9月8日到，每月4杜卡特。